白芷生物碱对HeLa细胞的抑制作用

王建新 马翠花

(秦皇岛市第一医院检验科，河北 秦皇岛 066000)

多年来，国内外学者对白芷进行深入研究，发现其具有防晒、防紫外线及抑制酪氨酸酶作用〔1〕，因此开发出大量白芷产品如药品、保健品、化妆美容品等〔2〕。最近，研究者又发现白芷具有增强免疫、促进生长〔3〕、促进仓鼠肺细胞增殖〔4〕和抗肿瘤作用，日本上原靖洋〔5〕研究表明，白芷果实甲醇提取物对肿瘤细胞(MK-1、B16F10、HeLa)增殖有抑制活性。白芷中主要成分为香豆素类和挥发油，此外还含有胡萝卜苷、生物碱及钙、铜、铁、锌、镍、镁等人体必需的微量元素〔6〕。目前研究多集中在白芷香豆素和挥发油上，而对白芷生物碱(AAD)对宫颈癌的作用，尚未见报道。本研究拟探讨AAD对宫颈癌的抑制作用，为临床开发新的有效的抗肿瘤中草药奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1化学试剂盒细胞株 提取的白芷冻干粉用RPMI-1640培养基配制成储存液备用。RPMI-1640(Gibco公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，二甲基亚砜(DMSO)、胰蛋白酶、乙二胺四乙酸(EDTA)、噻唑蓝(MTT)、Hoechst 33342及碘化丙啶(PI)为Sigma公司产品。

1.1.2细胞株 人宫颈癌Hela细胞株购自协和医科大学基础医学研究所。

1.2方法

1.2.1药物提取 将白芷粉末500 g用水浸泡12 h以上，超声振荡2 h左右，回收取水相，进行第二次超声，收取所有的水溶液；热水器加热到1 750 ml处，调pH为2～3，3 000 r/min离心10 min，取上清，旋转蒸发仪浓缩达到400 ml，25次萃取；pH值调至2～3，浓硫酸和正丁醇溶液进行萃取，超声波辅助萃取，终产物用浓NaOH将其pH值调至9～10，正丁醇萃取出生物碱，pH值保持在2～3之间；此时，生物碱易溶于酸液中，最终正丁醇蒸馏回收；调pH值7～7.5，中性偏碱，用旋转蒸发仪进行浓缩，烘干，直到得到结晶物，即总生物碱(1 g)。

1.2.2生物碱鉴定 用高氯酸滴定法测定白芷中生物碱质量分数达99%以上。用酸性染料比色法测定，可分出与碘化钾试剂呈色的杂志斑点，证明白芷中有关物质主要为其有关生物碱。

1.2.3细胞培养及收集 将HeLa细胞单层接种在含10%小牛血清的RPMI-1640(含100 U/μl的青霉素和100 U/μl的链霉素)培养瓶内，完全培养基按1×105的浓度接种在培养瓶内，置入37℃、5%CO2培养箱。3 d传代一次，所有实验均在细胞处于对数生长期进行。

1.2.4MTT测量HeLa细胞接种于96孔培养板中(细胞数为每孔5×104个)培养12 h，加入不同浓度的AAD，使其终浓度为：100、200、400 μg/ml，每个浓度设四个平行复孔，阴性对照组为等体积RPMI-1640完全培养液，并设空白调零孔(只加完全培养液，不加细胞)，于37℃，5%CO2培养箱中继续培养24 h，每孔加入MTT 20 μl,继续培养4 h后，加入150 μl DMSO溶解，于酶标仪492 nm处检测，计算药物的体外生长抑制率，用细胞生长抑制率对药物作用时间绘制回归曲线，求出半数抑制浓度(IC50)。细胞生长抑制率(%)=(对照组平均OD值-用药组平均OD值)/对照组平均OD值×100%。

1.2.5荧光染色计算凋亡指数(AI) 取不同组别的对数生长期HeLa细胞，镜下计数，调整浓度为5×105/ml，悬浮于1 ml培养基中，加入10 μl Hoechst 33342染液，混匀，37℃孵育5～15 min；细胞于4℃下500～1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入1.0 ml Buffer A悬浮细胞和PI染液5 μl，避光混匀，荧光显微镜下观察。Hoechst 33342用氪激光激发的紫外光，激发波长为352 nm，产生蓝色荧光，PI用氩离子激光激发荧光，激发光波波长为488 nm，产生红色荧光。蓝绿色为凋亡细胞，红色为坏死细胞。计数200个细胞，计算AI，AI=凋亡细胞数/总细胞数×100%〔7〕。

1.2.6流式细胞仪检测细胞周期的变化 取对照和药物(AAD 400 μg/ml)处理过的HeLa单细胞悬液(1×106ml)1 ml，磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，然后加入预冷的1×Binding 缓冲液，再加入Annexin V-FITC液5 μl和PI液10 μl，混匀，室温避光染色15 min。PBS洗2次，去除多余染料，流式细胞仪检测(激发波长488 nm)。

2 结 果

2.1MTT测量结果 AAD对Hela细胞生长有明显抑制作用，且随着剂量的增高而增高，其药物浓度与抑制率呈正性直线关系。见表1、图1。

表1 AAD对HeLa细胞生长抑制作用

图1 AAD对HeLa细胞生长抑制作用

2.2荧光染色计算AI AAD作用12 h后，细胞开始出现凋亡，24 h和48 h凋亡细胞增多，72 h凋亡细胞明显增加，AAD诱导HeLa细胞凋亡具有时间、剂量依赖性。不同浓度的AAD在不同作用时间，随着浓度增加、时间增加，AI增加。见表2。

表2 AAD在不同的作用时间诱导HeLa细胞凋亡指数的变化(%)

2.3流式细胞仪检测细胞周期的变化 细胞周期分析发现，400 μg/mlAAD作用12 h，可见Hela细胞G2/M百分比增高为19.98%；作用36 h，G2/M百分比达32.45%，而未经AAD作用的Hela细胞增殖正常，提示AAD通过抑制Hela细胞分裂而降低其增殖能力。见表3。

表3 AAD对HeLa细胞周期的影响(%)

3 讨 论

化学抗癌药物主要通过诱导肿瘤细胞的凋亡达到治疗的目的。因此，细胞凋亡被视为评估疗效的一项新指标。如何诱导和调控肿瘤细胞凋亡已成为目前抗肿瘤治疗的研究热点。细胞凋亡在胚胎发生、器官发育及保持机体内环境的稳定等正常生理过程起着十分关键的作用，并在调控细胞的增殖、肿瘤的发生和生长中起重要作用〔8～10〕。近年来的研究证明，细胞凋亡规律失常与肿瘤发生密切相关。如果受损的细胞不能正确启动凋亡机制，机体内细胞增殖与凋亡两者间的平衡遭到破坏，使细胞过度增生，就有可能导致肿瘤。在目前的抗癌药物中，无论是细胞周期特异性药物，还是细胞周期非特意性药物，对癌细胞的杀伤作用都服从一级动力学原理，即只能按比例而不能全部杀伤肿瘤细胞。因此，寻求高效诱导细胞凋亡的药物，在杀伤残存癌细胞的同时又能避免对正常细胞的杀伤，具有非常重要的意义。中药诱导肿瘤细胞凋亡具有一定的可行性基础〔11〕。本实验将AAD(100～400 μg/ml)直接作用于HeLa细胞上，发现AAD不仅可明显地抑制细胞生长，而且显著地诱导细胞凋亡，并且作用强度在一定范围内呈现对浓度和时间的依赖性。因此认为AAD是一个有广泛应用前景的抗癌新药，其诱导肿瘤细胞凋亡是治疗子宫癌的重要机制，为临床使用提供一定的理论基础。

4 参考文献

1尚 靖,敖秉臣,刘文丽.七种增白中药对酪氨酸酶的影响〔J〕. 中国药学杂志， 1995;30(11):653-5.

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3范卫新,朱文元.55种中药对小鼠触须毛囊体外培养生物学特性的研究〔J〕. 临床皮肤科杂志,2001;30(2):81.

4曲见松,康学军,王林波.白芷多糖的提取纯化及其对仓鼠肺细胞生长作用的研究〔J〕. 山东中医杂志,2005;24(3):172-4.

5上原靖洋.关于肿瘤细胞增殖抑制成分的研究:白芷中的活性成分〔J〕. 国外医学.中医中药分册,2002;24(4):4247-8.

6张富强,聂 红,韦 艺,等.白芷的化学与药理研究进展〔J〕. 南京中医药大学学报(自然科学版),2002;18(3):190-2.

7马东礼,肖家祁,童善庆,等.榄香烯诱导Hela细胞凋亡的实验研究〔J〕. 上海第二医科大学学报,2000;20(6):484-7.

8Staunton MJ,Gaffney EF.Apoptosis:basic concepts and potential significance in human cancer〔J〕. Arch Pathol Lab Med,1998;122(4):310-9.

9沈 蕾.细胞凋亡与肿瘤的关系〔J〕. 临床儿科杂志,2002;20(10):638-40.

10Hannun YA.Apoptosis and the dilemma of cancer chemotherapy〔J〕. Blood,1997;89(6):1845-53.

11周语平,杨志军,陈 彻.细胞凋亡与肿瘤〔J〕. 甘肃中医学院学报,2003;20(4):48-51.