缺血后处理对缺血再灌注大鼠脑排斥导向分子A表达及轴突损伤的影响

孔渝菡 秦新月 冯金洲 陶 涛

(重庆医科大学附属第一医院康复医学科，重庆 400016)

缺血再灌注过程往往加重组织细胞功能代谢障碍及结构破坏，产生再灌注损伤并产生级联效应释放大量神经抑制因子，阻碍脑损伤后神经的修复。缺血后处理(IPC)是减少脑缺血损伤的一种重要内源性保护性措施，但其保护机制仍待进一步研究〔1〕。排斥导向分子A(RGMa)是近年发现神经再生的排斥性导向分子，本研究观察IPC对局灶性缺血再灌注大鼠RGMa表达以及轴突损伤的影响。

1 材料与方法

1.1实验分组及缺血后处理 成年SD大鼠50只，体重250～280 g，雌雄各半，购自重庆医科大学实验动物中心。实验过程中动物饲养及取材均遵守实验动物管理和保护的有关规定。动物随机分为为假手术组、缺血/再灌注组、缺血后处理组，分两个时间点，各组5只。大鼠腹腔注射3.5 %水合氯醛(1 ml/100 g)麻醉，假手术组为分离并结扎大鼠右侧颈外动脉；缺血/再灌注组参照Longa等〔2〕报道使用线栓法制作大鼠右大脑中动脉缺血模型，缺血2 h后将栓线移出大脑动脉环开始再灌注。缺血后处理为缺血/再灌注后再灌注起始时立即进行双侧颈总动脉夹闭10 s，恢复血流10 s，如此反复6次夹闭/再通的过程。

1.2大鼠神经功能缺损评分 参照Longa等〔2〕评分标准，根据无、轻度、中度、中重度、重度神经功能缺失及缺血症状加重，分别评为0～4分。

1.3大鼠脑梗死容积测量 大鼠脑缺血/再灌注2 d后，过度麻醉并处死取脑，做2 mm连续冠状切片5 片，将脑片置于TTC溶液37 ℃避光孵育30 min。拍照并用Image-Pro Plus(IPP)6.0 计算脑梗死容积。总体积=各平面面积总和×2 mm厚度，梗死体积百分率= (正常侧大脑半球体积-梗死侧非梗死区脑组织体积)/正常侧大脑半球体积×100%。

1.4RT-PCR检测RGMa mRNA表达 从GenBank中找出并根据RGMa和β-actin基因序列设计引物送重庆升博生物技术公司合成。RGMa上、下游引物分别为5′-GCTGGATGGATGGGTATGGG-3′和5′-GCCGCAGTGAGTGTAGTTGG-3′，扩增片段长度456 bp；β-actin上、下游引物分别为5′-CGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3′和5′-CGGACTCATCGTACTCCTGCT-3′，长度229 bp。取于液氮冷冻。各取100 g右侧大脑中动脉供血区皮质、海马提取总RNA，经逆转录及PCR反应，将扩增产物于2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果并照相，Quantity One软件进行定量分析，以RGMa与β-actin条带平均光密度比值表示目的基因mRNA的相对表达量。RNA提取液Trizol及RT-PCR反应试剂盒(大连宝生物工程有限公司)、PCR仪及ChemiDoc xRS凝胶扫描成像系统(美国Bio-Rad公司)。

1.5免疫组织化学检测RGMa及轴突神经丝蛋白(NF)-200蛋白表达 大鼠麻醉、灌注后取脑，放入4%PFA中固定，24 h后做石蜡包埋，制作石蜡切片(片厚4 μm)。用二甲苯和梯度酒精脱蜡，3% H2O2灭活内源性过氧化物酶10 min，枸橼酸缓冲液热修复抗原6 min×4次，1% TritonX细胞通透20 min，山羊血清封闭30 min，RGMa兔多克隆抗体(1∶50，英国Abcam公司)及小鼠抗NF-200一抗(1∶100，武汉博士德生物技术有限公司)孵育并于4℃过夜。再用生物素标记的山羊抗兔IgG/山羊抗小鼠IgG孵育，辣根酶标记的链霉卵白素孵育30 min， 二抗试剂盒(北京中杉生物技术有限公司)。最后二氨基联苯胺(DAB)显色、梯度脱水及封片。

2 结 果

2.1各组各时间点大鼠神经功能评分及脑梗死体积 与缺血/再灌注组相比，缺血后处理组大鼠12、24 h、2 d的神经功能缺失症状明显减少(P<0.05)。见表1。缺血后处理组脑梗死体积百分数〔(16.38±3.68)%〕较缺血/再灌注组〔(33.14±6.15)%〕降低(P<0.01)。

2.2各组各时间点大鼠皮质及海马RGMa mRNA表达 后处理组缺血侧皮质及海马RGMa mRNA表达比缺血/再灌注组明显降低(P<0.01)，1 w后差异仍显著(P<0.05)。见图1，表2。

2.3各组各时间点大鼠脑皮质及海马RGMa蛋白表达 免疫组织化学染色发现RGMa在正常脑皮质及海马均有少量表达，而缺血/再灌注2 d后阳性神经元数目明显增多，但缺血后处理组与缺血/再灌注组比较RGMa表达减少(P<0.01)。轴突NF-200染色发现缺血/再灌注组2 d缺血侧皮质及海马神经元轴突表达明显减少(P<0.01)，缺血部分区域的轴突破坏明显，轴突排列紊乱，纤维数目较假手术组显著减少，着色变浅，纤维变短变细。缺血后处理组与相应时间点缺血/再灌注组比较显示，前者NF-200表达均有增加(P<0.01)。见图2，图3，表3，表4。

M:标记物；1:空白对照；2:假手术组；3:缺血再灌注组；4:缺血后处理组

表1 各组大鼠神经功能的评分

图2 大鼠脑缺血/再灌注48 h时RGMa蛋白表达(免疫组织化学染色，×400)

图3 大鼠脑缺血/再灌注48 h时NF-200蛋白表达(免疫组织化学染色，×200)

表2 各组大鼠缺血侧皮质及海马RGMa mRNA表达

表3 各组大鼠缺血侧皮质及海马RGMa光密度值

表4 各组大鼠缺血侧轴突NF-200的平均光密度变化

3 讨 论

IPC是近年发现的通过诱导靶器官缺血耐受从而减少缺血损伤，实现功能保护的强有效内源性保护措施。 其良好的保护作用已在心、脑、肾、消化系统等多种重要器官的缺血性损伤中得到证实〔1，3〕。体外缺血模型实验对皮质神经元进行反复多次糖氧剥夺的后处理相比单纯糖氧剥夺的对照组损伤减少〔4〕。本研究的前期工作也发现缺血后处理能够明显减少缺血再灌注后大鼠脑内的炎症介质释放〔5〕，进一步证实了这一方法的有效性。本实验采用线栓法制作大脑中动脉梗死模型，并对实验大鼠进行再灌注，更接近临床常见的缺血性脑卒中类型。后处理方式选取了快速后处理，通过6次×10 s/次的近端后处理，大鼠脑梗体积平均减少50.57%，提示了早期近端后处理保护缺血组织的有效性。

尽管已经有研究表明，缺血预处理与IPC的器官保护分子机制类似，可能通过Akt、MAPK、PKC通路，KATP通道开放〔6，7〕实现，但其具体作用机制仍有待明确。RGM家族是一种被糖基磷脂酰肌醇锚定的细胞-膜相关蛋白，编码产生RGMa、RGMb、RGMc 3种蛋白，其中RGMa和RGMb存在于神经系统，而RGMa主要存在于中枢神经系统发挥调控轴突生长的排斥作用，它与其他已知轴突导向分子没有序列同源性〔8，9〕。RGMa与受体Neogenin结合后激发Rho A、Rho激酶、PKC活化，导致生长锥塌陷〔10，11〕。本研究结果提示其作为一种轴突生长导向的分子在缺血的过程中被活化而可能参与缺血再灌注损伤后神经修复过程，在IPC组，RGMa的表达在缺血48 h及7 d均较缺血组减少，轴突数量和NF-200表达较缺血/再灌注组明显增多，形态更完整，说明RGMa在缺血再灌注损伤过程中成为轴突生长的阻碍因素，而IPC起到轴突保护作用。

本研究表明，在脑缺血再灌注起始时进行短暂、多次的缺血和再灌注后处理能够有效减少大鼠脑梗死体积，使神经功能缺损改善，减轻轴突损伤与促进恢复，其脑保护机制可能与抑制RGMa/neogenin信号通路激活有关，从而为IPC的器官保护机制研究提供了一条新的途径。

4 参考文献

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2Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S,etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke，1989；20(1):84-91.

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4Prasad SS，Russell M，Nowakowska M.Neuroprotection induced in vitro by ischemic preconditioning and postconditioning：modulation of apoptosis and PI3K-Akt pathways〔J〕.J Mol Neurosci，2011；43 (3):428-42.

5孔渝菡,秦新月.不同缺血后处理对缺血再灌注大鼠脑内IL-1β、IL-6表达的影响〔J〕.中国老年学杂志，2012；32(14):2984-6.

6Gao X，Zhang H，Takahashi T,etal.The Akt signaling pathway contributes to postconditioning′s protection against stroke；the protection is associated with the MAPK and PKC pathways〔J〕.J Neurochem，2008；105 (3):943-55.

7Robin E，Simerabet M，Hassoun SM,etal.Postconditioning in focal cerebral ischemia：role of the mitochondrial ATP-dependent potassium channel〔J〕.Brain Res，2011；1375(1)：137-46.

8尹红蕾，秦新月.RGMa及其在缺血性脑损伤后中枢神经再生中的作用〔J〕.神经损伤与功能重建，2008；3(3):199-200.

9Severyn CJ，Shinde U，Rotwein P.Molecular biology，genetics and biochemistry of the repulsive guidance molecule family〔J〕.Biochem J，2009；422 (3):393-403.

10Schnichels S，Heiduschka P，Julien S.Different spatial and temporal protein expressions of repulsive guidance molecule a and neogenin in the rat optic nerve after optic nerve crush with and without lens injury〔J〕.J Neurosci Res，2011；89(4):490-505.

11Endo M，Yamashita T.Inactivation of Ras by p120GAP via focal adhesion kinase dephosphorylation mediates RGMa-induced growth cone collapse〔J〕.J Neurosci，2009；29(20):6649-62.