Neuropilins-1和Neuropilins-2在人脑胶质瘤中的表达

王睿君 王育民 刘雁飞 高建梅 包丽薇 戴军有

(内蒙古医科大学附属医院，内蒙古 呼和浩特 010050)

人脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的肿瘤，起源于神经上皮细胞，占所有原发性脑肿瘤的50%左右〔1～4〕。Neuropilins(NRPs)参与多种生理功能，包括轴突导向、细胞迁移、组织形成、调节血管生成、神经创伤的修复〔1～3〕、信号传导以及诱导神经元细胞的凋亡和分化〔4〕。本实验中我们采用免疫组化方法联合检测Neuropilins-1(NRP-1)及Neuropilins-2(NRP-2)在脑胶质瘤中的表达情况，分析其与胶质瘤级别的关系及相关性。

1 资料与方法

1.1实验材料 收集2008年1月至2012年1月在内蒙古医科大学第一附属医院神经外科就诊，临床资料保存完整的病例，行手术切除治疗，术前未行放疗和化疗，术后病理诊断均为神经胶质瘤，其中Ⅰ级胶质瘤4例，Ⅱ级胶质瘤25例，Ⅲ级胶质瘤20例，Ⅳ级胶质瘤20例，其中Ⅰ+Ⅱ组为低恶性组，Ⅲ+Ⅳ组为高恶性组。另取5份正常脑组织标本作为对照，标本均为同期急性颅脑损伤患者因颅内减压而切除的脑组织，液氮冻存备用。

1.2仪器与试剂 微波炉、切片机、光学显微镜、显微照相系统、微量移液器以及免疫组化所需其他材料(均由内蒙古农业大学动物教研室提供)。兔抗人NRP-1、NRP-2单克隆抗体、S-P免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司。

1.3免疫组化染色 所有标本均用10%的甲醛固定，石蜡包埋，所有切片均有专业技术人员切成厚4 μm。应用免疫组化检测，简述如下：①组织芯片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化；双蒸水洗5 min，PBS漂洗3 min×3；②热修复抗原：微波热诱导抗原修复(760 W功率微波炉3档)20 min，室温冷却；PBS漂洗3 min×3；③室温下3%H2O2抑制内源性过氧化物酶20 min；PBS洗3 min×3；④20%正常羊血清室温孵育30 min，不洗；⑤芯片分别置于兔抗人NRP-1、NRP-2多克隆抗体中，4℃孵育过夜；⑥即用型EnVision试剂37℃孵育30 min；PB漂洗3 min×3；⑦DAB显色20 min，苏木素复染2 min，脱水、透明、封片。以PBS代替一抗作阴性对照，用随试剂附已知阳性对照片作阳性对照。

1.4结果判断 结果判定在盲法下进行，每张芯片由两名病理医师分别计数。染色强度计分：0分为无色；1分为淡棕黄色；2分为棕黄色；3分为棕褐色。阳性细胞百分率：0分为阳性细胞百分率≤5%；1分为6%～25%；2分为26%～50%；3分为51%～75%；4分为≥75%。计算得分：0～2分为阴性；3～4分为弱阳性(+)；5～6分为阳性()；7～8分为强阳性()。

1.5统计学方法 SPSS13.0 统计软件，组间比较采用秩和检验，各指标之间的相关性分析采用Spearman等级相关。

2 结 果

2.1NRP-1在各级脑胶质瘤中的表示 脑胶质瘤中NRP-1表达阳性率明显高于正常脑组织(P<0.05)，且NRP-1阳性表达率随肿瘤分级增高而增强(P<0.05)。见表1，图1。

图1 NRP-1在各级脑胶质瘤中的表达(DAB，×200)

2.2NRP-2在各级脑胶质瘤中的表达 脑胶质瘤中NRP-2表达阳性率明显高于正常脑组织组(P<0.05)，且NRP-2随肿瘤分级增高，表达也明显增强(P<0.05)。见表1，图2。

图2 NRP-2在各级脑胶质瘤中的表达(DAB，×200)

表1 NRP-1与NRP-2在各级胶质瘤中的阳性表达〔n(%)〕

3 讨 论

NRPS是一种多功能信号传导蛋白，在机体的发育、免疫和肿瘤的发生发展中扮演着重要的角色〔5～9〕。NRP-1或它的同族NRP-2受体，能够促进对一些生长因子或其他介导生理学低下和病理学条件的反应。他们在一些内皮细胞、几个正常种类的细胞和恶性肿瘤细胞中表达〔9～11〕。NRP-1和NRP-2在分担许多结构和生物学性能上有44%的同源性〔5～9〕。研究表明〔10〕，NRP-1或NRP-2表达于多种人类肿瘤细胞系，包括前列腺癌、肾癌、膀胱癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌和卵巢癌，也表达于来自于胶质母细胞瘤、神经细胞瘤、骨肉瘤、白血病和黑色素瘤的细胞系，而且NRPs与恶性肿瘤的血管、淋巴管的新生和转移都密切相关。

本研究结果显示，随着胶质瘤的等级增加，NRP-1、2表达而加强。NRPS既是介导神经原导向Semaphorins家族的受体，也是血管内皮生长因子(VEGF)的受体，所以NRP-1、2表达的增高，可增加肿瘤的毛细血管密度的增加，间接的为肿瘤细胞的生长和沿血管扩散提供了有利条件。Osada等〔12〕用免疫组织化学和RT- PCR 法研究发现在人神经胶质瘤临床病理标本中NRP-1显著表达，并且表达强度随神经胶质瘤恶性程度增加而增强，Adham等〔13〕揭示NRP-1的表达水平与卵巢上皮细胞癌的恶性程度有关，并且NRP-1能够促进卵巢癌血管新生及癌细胞的浸润和转移。Jubb等〔10，11〕通过染色与抗体的免疫组化及原位杂交严格验证分析，他们观察到肿瘤脉管系统NRP-1〔10〕和NRP-2〔11〕在绝大多数情况下是阳性；NRP-2在乳腺癌和非小细胞肺癌的阳性率可以和NRP-1相提并论〔11〕；而NRP-2在黑色素瘤的阳性率为85%。NRP-2表达了更高的阳性率在乳腺癌中〔14〕。所以，NRPs不仅在肿瘤组织或稳定的细胞株中存在高表达，而且与其发生发展、血管生成及转移均密切相关。

4 参考文献

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10Jubb AM，Strickland LA，Liu SD，etal.Neuropilin-1 expression in cancer and development〔J〕.J Pathol，2012；226(1):50-60.

11Jubb AM，Sa SM，Ratti N，etal.Neuropilin-2 expression in cancer〔J〕.Histopathology，2012 Epub ahead of print.

12Osada H，Tokunaga T，Nishi M,etal.Overexpression of the neuropilin 1(NRP1) gene correlated with poor prognosis in human glioma〔J〕.Ant-icancer Res，2004；24( 2B)：547-52.

13Adham SA,Sher I,Coomber BL.Molecular blockade of VEGFR2 in human epithelial ovarian carcinoma cells〔J〕.Lab Invest,2010；90(5):709-23.

14Milpied P，Renand A，Bruneau J，etal.Neuropilin-1 is not a marker of human Foxp3+ Treg〔J〕.Eur J Immunol，2009;39：1466-71.