二甲酸精氨酸二甲胺水解酶-非对称性二甲基精氨酸系统对老年冠心病患者血管内皮细胞的影响

潘力健 龚 辉 刘 磊 王 昕

(复旦大学附属金山医院心血管内科，上海 201508)

冠心病是我国老年人群中常见的疾病，严重影响患者生存质量，是导致老年人群死亡的重要疾病之一，近年呈上升趋势〔1〕。研究表明〔2～4〕，血栓的形成是引起冠心病患者死亡的危险因素，而由组织因子(TF)启动的凝血系统在血栓形成过程中起到重要的作用，而一氧化氮(NO)是血管内皮功能中最重要的介质。近年相关研究指出〔5〕，内源性NO抑制物水解酶-二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH)、内源性NO合酶抑制物-非对称性二甲基精氨酸(ADMA) 属于内源性NO生成系统，对维持及稳定血管内皮细胞功能具有重要的作用。本文将对DDAH-ADMA系统对老年冠心病患者TF表达影响进行研究，并从血栓形成的角度分析ADMA在冠心病发病机制中的作用，为冠心病临床诊治提供新的研究思路。

1 资料及方法

1.1临床资料 选取本院2011年12月至2013年2月收治的45例老年冠心病患者为冠心病组，纳入标准：(1)患者均经冠状动脉造影术确诊；(2)年龄≥60岁；(3)在知情同意下参与研究；(4)入选病例获得本院伦理医学委员会审批。排除标准：全身性疾病感染、心源性休克、心脑血管、血液疾病、恶性肿瘤、肝肾功能异常等患者。男28例，女17例，年龄61～82〔平均(70.3±5.4)〕岁。根据Gensini积分对患者进行分级，其中1分：6例，2分：10例，4分： 8例，8分：11例，16分：10例。另选取40例老年健康体检者为对照组，男22例，女18例，年龄45～80〔平均(68.5±4.8)〕岁。

1.2方法

1.2.1DDAH mRNA测定 静脉抽取两组静脉血10 ml，采用RT-PCR(购于日本TAKAPA公司)测定两组外周血内皮祖细胞中DDAH mRNA含量，设计针对人DDAH PCR的探针序列以及荧光检测引物，选择人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，(由美国西格玛公司提供)作为测试的内参物，并采用Trizol试剂盒(美国Invitrogen公司)提取RNA，荧光定量PCR实验严格按照试剂盒操作说明进行。DDAH mRNA相对表达量=目的基因/内参基因。

1.2.2免疫组化法测定ADMA 静脉抽取两组静脉血10 ml，经离心处理后弃去下层混浊液，留取上清液，置于-20℃冰箱中保存待测，并采用ADMA酶联免疫试剂盒(由上海生物仪器设备公司提供)测定两组ADMA含量，操作过程严格按照试剂盒说明进行。

1.2.3NOS、TF、磷脂酰胆碱(LPC)的水平测定 采用胰蛋白酶对血浆细胞进行消化，并调整细胞浓度至2×103/ml，并按照1/1 000将无血清培养液稀释至10 μmol/L，并将样品置于37℃培养箱中孵化20 min，采用无血清细胞培养液对样本洗涤3次后，采用美国贝克曼库尔特有限公司提供型号EPICS流式细胞仪测定细胞中NO合酶(NOS)、TF、LPC平均荧光强度(单位为mfi)，检测细胞数目不应少于10 000个。

2 结 果

2.1两组 DDAH mRNA水平分析 冠心病组DDAH mRNA相对表达量为(0.78±0.21)，对照组相对表达量为(1.28±0.51)，随着患者Gensini积分升高，DDAH mRNA相对表达量显著下降，与对照组相比，冠心病组ADMA含量显著上升，且患者Gensini积分升高ADMA含量显著升高，两两相比差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2两组NOS、TF、LPC含量分析 冠心病组NOS、TF、LPC水平显著高于对照组，且随着Gensini积分升高，NOS、TF、LPC水平显著增加(P<0.05)，见表2。

2.3DDAH、ADMA与NOS、TF、LPC相关性分析 经相关性分析可知，DDAH与NOS、TF、LPC呈负相关(r分别为-0.362、-0.376、-0.039，均P<0.05)，而ADMA与NOS、TF、LPC呈正相关(r分别为0.402、0.396、0.358，均P<0.05)。

表1 各组 DDAH mRNA、ADMA水平分析

表2 各组NOS、TF、LPC含量分析

3 讨 论

目前普遍认为冠心病的发病机制是血栓的形成及动脉粥样斑块破裂引起的，而TF血栓及斑块的形成过程中起到重要的促进作用〔6〕。血管内皮是血管间质细胞与血液之间的半透性膜，其对维持及稳定血流动力学具有重要的意义〔7〕。在正常状态下，内皮细胞几乎不产生TF，但当血管内皮出现病理性改变或血管功能形态受损时可诱导血管产生大量的TF，并激活纤维蛋白原及凝血酶原，进而促进血栓形成〔8〕。在NOS催化作用下，细胞中L-精氨酸可大量生成NO，NO是维持及稳定血管内皮功能的重要物质，可抑制血栓的形成〔9〕。

ADMA属于内源性NOS抑制物，可抑制NO合成，进而对血管内皮造成损伤，破坏机体血流动力学平衡〔10〕。Davids等〔11〕长期给予小鼠ADMA物质，结果显示ADMA可引起小鼠微血管粥样化，与正常小鼠相比，其体内NO生成显著减少。近期研究指出〔12〕，ADMA可诱导血管内皮细胞老化及凋亡，并可抑制血管新生，促使血管泡沫细胞形成，增加内皮细胞黏附，促进血栓形成。近年研究指出〔13〕，ADMA是以甲基化蛋白作为底物经甲基化转移酶催化生成的，是由于DDAH代谢失活引起的，因此采用DDAH抑制剂可有效抑制DDAH基因过度表达。DDAH主要分布在内皮型NOS组织中。Ivashchenko等〔14〕研究指出在内皮细胞培养过程中增加NO浓度，能有效抑制DDAH活性，而降低DDAH活性则使得细胞内ADMA水平增加，从而抑制NOS活性，使得NO生成减少，因此DDAH-ADMA系统属于内源性NO生成系统，DDAH-ADMA系统对维持及稳定血管内皮功能起到重要的调控作用。

本研究结果与伊桐凝等〔15〕一致，从而提示ADMA水平上升可抑制DDAH表达，且随着患者病情的进展，DDAH的表达量显著受到抑制。此外，本研究还提示ADMA水平上升与血管内皮功能障碍有密切关系，ADMA可诱导及促进内皮细胞老化及凋亡，介导机体炎症因子生成，促进动脉粥样硬化的形成。近年临床实验研究显示，冠心病患者血浆ADMA水平显著高于正常人群，且ADMA水平升高的患者其发生心血管事件的风险显著上升，且预后效果较差。ADMA可介导DDAH表达下降，使得NOS、TF、LPC表达上调，且随着患者病情的发展，DDAH水平显著上升，NOS、TF、LPC表达量显著增加，从而加重了对血管内皮的损伤。

综上，冠心病病情的发生及进展与DDAH-ADMA通路参与NOS、TF、LPC表达有密切关系，通过对DDAH-ADMA系统对血管内皮细胞影响机制的研究，可更好地了解冠心病发病的机制，为临床冠心病防治提供新的治疗思路。

4 参考文献

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9Yi TN,Zhang J,Yu SJ,etal.Alterations in reactive oxygen species and dimethylarginine dimethylaminohydrolase-asymmetric dimethyl-arginine system in the process of endothelial cell senescence induced by high glucose〔J〕.Zhongguo Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue,2011；23(5):275-8.

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12张 威,袁伟杰,陈 博,等.ADMA-DDAH路径在尿酸引起血管内皮损伤中的作用〔J〕.中华肾脏病杂志,2011；27(1):17-22.

13刘秀娟,穆 恩,梁英健,等.高糖培养脂多糖刺激下肺脏微血管内皮细胞通透性改变及DDAH/NOS/NO失平衡在其发生机制中的作用〔J〕.中国危重病急救医学,2013；25(3):140-4.

14Ivashchenko CY,Bradley BT,Ao Z,etal.Regulation of the ADMA-DDAH system in endothelial cells:a novel mechanism for the sterol response element binding proteins,SREBP1c and -2〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2010；298(1):251-8.

15伊桐凝,张 锦,于世家,等.高糖诱导人脐静脉内皮细胞衰老过程中活性氧与二甲基精氨酸二甲胺水解酶-非对称性二甲基精氨酸系统的变化〔J〕.中国危重病急救医学,2011；23(5):275-8.