右归丸对EAE小鼠Th17细胞分化的影响

郑子安 钟相根 贾 旭 王 坦

(北京中医药大学基础医学院，北京 100029)

多发性硬化症(MS)是一种缓慢进展的中枢神经系统自身免疫性炎性脱髓鞘疾病〔1〕，其发病机制尚未阐明。新近研究表明，Th17细胞是炎症反应和自身免疫性疾病中一类重要的效应细胞〔2〕。目前，西医尚无特效疗法，临床上治疗MS的药物包括糖皮质激素、β-干扰素、环孢霉素A等。这些药物虽可明显改善MS患者急性期的临床症状，但尚无循证医学的证据表明其可有效控制疾病复发及减缓疾病进展，而且由于毒副作用限制了它们的临床应用，不宜作为长期维持治疗用药。近年来，我国学者研究表明，右归丸可有效治疗大鼠EAE〔3，4〕，本研究观察右归丸对EAE小鼠血清IL-4、IL-6、TGF-β、IL-17含量的影响，探讨右归丸能否通过抑制Th17细胞分化，进而治疗EAE。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF级C57BL/6小鼠，雌性，40只，6～8周龄，体质重18～20 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司〔许可证号：SCXK(京)2007-0001〕，饲养于北京中医药大学实验动物中心。

1.2试剂及仪器 MOG35-55，纯度>97.25%，肽序列为MEVGW YRSPF SRVVH LYRNGK(生工生物工程(上海)有限公司)。完全弗氏佐剂(Complete Freud's Adjuvant，CFA)购于sigma。百日咳毒素(Pertussis toxin)来源于Bordetella pertusssis。人结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，H37Ra) (Difco company，USA)。ELISA试剂盒购自欣盛博生物科技有限公司。

1.3实验分组及处理 将EAE模型小鼠随机分为模型组、激素组、右归丸组，另设正常对照组，共4组，每组10只。免疫后，按组别分别做如下处理：模型组每天给予生理盐水灌胃；激素组每天给予生理盐水灌胃，发病后改为醋酸泼尼松混悬液(7 mg/kg，用生理盐水配制成要求的浓度)；右归丸组每天给予右归丸(4.2 g/kg，用生理盐水配制成要求的浓度)混悬液灌胃。正常对照组：相同条件和环境中饲养，不作任何处理。

每组实验小鼠在造模后于免疫后第30天取材。分离血清，4℃保存待测。HE染色观察取材用10%水合氯醛经腹腔注射麻醉小鼠，剪开胸部，将灌注针由左心室穿入主动脉，依次注入0.9%生理盐水、4%多聚甲醛；经心灌注30 min后，完整取出脑组织固定于0.1 kg/L甲醛磷酸缓冲液中24 h，石蜡包埋以备切片；取出石蜡块连续切片，5 μm切片行HE染色。

1.4小鼠EAE模型建立 按照课题组建立的方法构建EAE小鼠模型〔5〕。具体实验步骤如下：将MOG35-55(4 mg/ml，用灭菌后PBS配制相应浓度)与等体积的CFA(含4 mg/ml的H37Ra)用已经灭菌玻璃注射器充分乳化。用乙醚麻醉C57BL/6小鼠，分3点给小鼠背部皮下注射(100 μl/只)乳化液。背部两肩正中、后背部中线两侧各33.3 μl。最终每只小鼠皮下注射的MOG35-55和H37Ra均为200 μg。在免疫当天给每只小鼠腹腔注射400 ng PTX。在免疫72h后给每只小鼠再次腹腔注射400 ng PTX。

1.5小鼠神经功能评分 从初次免疫第0天起至第30天实验终止前，采用盲法，每天2人至少一次在同一时间按Benson评分标准对EAE严重性进行临床评估。0分，没有明显疾病症状；1分，尾巴张力消失或者后肢无力；2分，尾巴张力消失和后肢无力；3分，后肢部分瘫痪；4分，后肢完全瘫痪；5分，濒死状态或者死亡。

1.6ELISA法检测IL-4、TGF-β、IL-6、IL-17含量 按试剂盒操作说明，检测血清中IL-4、TGF-β、IL-6、IL-17含量。

2 结 果

2.1血清IL-4、TGF-β、IL-6、IL-17含量变化 如表1所示，模型组IL-6、IL-17含量比正常组升高，IL-4、TGF-β含量比正常组降低(P<0.05，P<0.01)。与模型组比较，右归丸及泼尼松组IL-6、IL-17含量降低，IL-4、TGF-β含量升高(P<0.05，P<0.01)。

2.2EAE小鼠发病率、神经功能评分及体重变化 免疫诱导后15 d开始，小鼠逐渐发病，表现为活动减少、体重减轻、尾部及四肢无力，符合EAE小鼠模型表现。右归丸及泼尼松干预后发病率降低、神经功能评分及体重减轻均明显改善。各组小鼠发病率、神经功能评分、体重变化分别见图1、图2、图3。

表1 各组小鼠调控Th17细胞分化的细胞因子比较

图1 各组小鼠发病率比较

图2 各组小鼠神经功能评分比较

图3 各组小鼠体重变化比较

2.3EAE小鼠脑组织病理学改变 HE染色观察，正常对照组未见明显的炎症改变。EAE模型组小鼠大脑实质内可见大量炎症细胞浸润，部分微血管周围被炎症细胞围绕，形成典型的“血管袖套样”改变。右归丸及泼尼松组脑组织炎性细胞浸润明显改善。

3 讨 论

EAE与人类MS的病理变化极其相似，是研究MS 的经典动物模型。长期以来，EAE/MS被认为是以IL-12诱导的Th1细胞反应为主的自身免疫性疾病。然而，一系列的矛盾困扰着人们。如IL-12是Th1分化的关键因子，IL-12基因敲除小鼠仍能产生EAE〔6〕。IFN-γ是Thl的重要致病因子，然而IFN-γ基因敲除小鼠仍能诱导产生EAE，而且恢复缓慢。Th17细胞的发现和IL-23功能的研究，解释了以上的困惑。

Th17细胞是新近发现的一类CD4+细胞亚群，因其独特的表型特征和分泌IL-17而得名，是和Th1细胞亚群、Th2细胞亚群相对应的一组细胞亚群〔7，8〕。Th17细胞亚群具有高度的致病性，Th17细胞和IL-17在EAE的发生发展中起关键性作用〔9〕。Th17细胞通过分泌一系列的促炎因子如IL-17、IL-17F、TNF-α、IL-6而发挥作用。IL-17作为IL-17家族的代表性因子，可以发现在EAE中表达升高；IL-17基因敲除小鼠对EAE不敏感；抗IL-17抗体可以使EAE症状明显减轻〔10〕。TGF-β与IL-6的协同作用是诱导Th17细胞分化的关键因子，TGF-β与IL-6能促进幼稚性Nalve CD4+细胞向Thl7细胞分化〔11〕。其中IL-6 起着关键性的作用，IL-6基因敲除小鼠EAE表现明显减轻；在小鼠EAE模型中使用IL-6抗体后，IL-17的分泌明显减少，且小鼠症状明显减轻〔12〕。TGF-β的免疫调节功能呈现剂量依赖性，低浓度时表现为协同IL-6诱导Th17细胞的分化，而在高浓度时则诱导CD4+CD25+调节性T细胞的分化，其中前者可以诱导EAE的发生而后者介导免疫抑制〔13〕。而Th2型细胞因子IL-4对Th17细胞分化起抑制作用〔14〕。

既往研究表明，右归丸可有效治疗大鼠EAE。本实验研究显示，右归丸可改善EAE小鼠神经功能评分，降低EAE小鼠血清IL-6、IL-17含量，升高IL-4、TGF-β含量，提示右归丸可通过抑制Th17细胞分化而起到抗感染治疗作用，进而改善EAE神经功能评分。

综上，右归丸能够通过影响Th17细胞分化，起到抗感染治疗作用，为右归丸在多发性硬化中的应用提供新理论依据。

4 参考文献

1Holmöy T.Immunopathogenesis of multiple sclerosis：concepts and controversies〔J〕.Acta Neurol Scand Suppl，2007；187:39-45.

2Zhou W，Dowell DR，Huckabee MM,etal.Prostaglandin I2 signaling drives Th17 differentiation and exacerbates experimental autoimmune encephalomyelitis〔J〕.PLoS One，2012;7(5):e33518.

3叶 明，樊永平，王 蕾.左归丸与右归丸对EAE大鼠淋巴细胞亚群和NK细胞的影响〔J〕.中华中医药杂志，2009；24(3)：310-3.

4樊永平，宋丽君，叶 明.左归丸和右归丸对自身免疫性脑脊髓炎大鼠中枢神经系统淋巴细胞亚群免疫组化表达的影响〔J〕.中国中医药信息杂志，2010；17(6)：44-7.

5Zhu YN，Zhong XG，Feng JQ,etal.Periploside E inhibits experimental allergic encephalomyelitis by suppressing interleukin 12-dependent CCR5 expression and interferon-gamma-dependent CXCR3 expression in T lymophocyte〔J〕.J Pharmacol Exp Ther,2006；318(3):1153-62.

6Zhang GX，Bruno GN，Shuo YU,etal.Induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in IL-12 receptor-β2-deficient mice：IL-12 responsiveness is not required in the pathogenesis of inflammatory demyelination in the central nervous system〔J〕.J Immunol，2003；170：2153-60.

7Harrington LE，Hatton RD，Mangan PR,etal.Interleukin 17-producing CD4+effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages〔J〕.Nat Immunol，2005;6(11):1123-32.

8Park H，Li Z，Yang XO,etal.A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17〔J〕.Nat Immunol，2005;6(11):1133-41.

9Komiyama Y，Nakae S，Matsuki T,etal.IL-17 plays an important role in the development of experimental autoimmune encephalomyelitis〔J〕.J Immunol，2006;177(1):566-73.

10Weaver CT.Th17：the ascent of a new effector T-cell subset〔J〕.Eur J Immunol，2009;39(3):634-6.

11Mangan PR，Harrington LE，O'Quinn DB，etal.Transforming growth factor-beta induces development of the T(H)17 lineage〔J〕.Nature,2006;441(7090):231-4.

12Okuda Y，Sakoda S，Bernard CC,etal.IL-6-deficient mice are resisitant to the induction of experimental autoimmune encephalomyelitis provoked by myelin oligodendrocyte glycoprotein〔J〕.Int Immunol,1998；10:703-8.

13Zhou L,Lopes J，Chong M，etal.TGF-B- induced Foxp3 inhibits Th17 cell differentiation by antagonizing RORCt function 〔J〕.Nature，2008；453(7192)：236-40.

14Wahl SM，Wen J，Moutsopoulos N.TGF-beta：a mobile purveyor of immune privilege〔J〕.Immunol Rev，2006;213:213-27.