吸烟对大鼠局灶性脑缺血后Caspase-3表达及细胞凋亡的影响

庄 严 王丹丹 柳忠兰 王建华 曹亦宾

(河北医科大学附属唐山工人医院神经内科,河北 唐山 063000)

细胞凋亡途径是缺血脑细胞损伤的重要环节之一。半脱氨酸蛋白酶(Caspases)家族是细胞凋亡程序中一类关键的同源半胱氨酸蛋白酶，Caspase-3是凋亡途径中多种死亡受体介导过程共同的下游效应部分，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路〔1〕，本实验以吸烟作为干预，参照Zea Longa线栓法〔2〕建立大鼠局灶性脑缺血模型，研究吸烟对脑缺血诱导的细胞凋亡和Caspase-3的表达和对其活性的影响情况，分析探讨吸烟对脑细胞缺血半暗带转归结果和机制的影响。

1 资料与方法

1.1动物和试剂 雄性Wistar大鼠8周龄，SPF级，体重(265±15) g，由中国医科大学实验动物部提供。 四氮唑红(TTC)：上海汉飞公司，原位细胞凋亡检测(TUNEL)试剂盒；兔抗大鼠Caspase-3 H-277：美国Santa Cruz公司；兔抗大鼠β-actin CH18-0054：美国ZY ED公司；香烟为国内普通市售品牌，尼古丁和焦油含量分别为1.2、16 mg/支。

1.2动物分组 本实验取筛选的60只健康的雄性Wistar大鼠，按照随机平均原则分为四组：缺血对照组、假手术组、吸烟组以及吸烟+缺血组。

1.3吸烟动物模型制备 采用改良的Chow等建立的烟灌注模型的方法，首先制备吸烟鼠箱，主要应用有机玻璃、角钢以及部分钢丝做成长60 cm，宽40 cm，高30 cm大小的鼠箱，然后在箱子的侧面以及斜对两侧各打两个直径和间距均为1 cm的孔，其中一侧的两孔连接双腔空气泵，两孔分别输入空气和烟雾；另一侧的两孔与外界相通，保证鼠箱与外界的氧浓度一样。连续12 w给予吸烟组以及吸烟+缺血组的Wistar大鼠吸烟干预刺激，一般吸烟量为20支/d。缺血对照组和假手术组的Wistar大鼠除了无吸烟干预其余处理方法一样。

1.4雄性Wistar大鼠大脑中动脉(MCA)栓塞模型(MCAO)的制备 主要是对缺血对照组和吸烟+缺血组的雄性Wistar大鼠建立MCAO模型，采用改良的Zea longa〔3〕的MCAO模型制备方法，具体步骤如下：采用氯胺酮(10 mg/kg)稀释后进行腹腔注射麻醉，在Wistar大鼠颈部作正中切口，钝性分离鼓泡腺，逐层暴露分离血管，主要有颈内、外动脉和颈总动脉，结扎血管时首先在颈总动脉扎一个活结，然后把渔线插进颈总动脉分叉处，结扎颈总动脉；然后再用微血管夹临时阻断颈内动脉的血液供应，在颈总动脉分叉处剪一长0.3 mm的小口，把渔线缓慢插入颈内动脉，有微阻感，一般深度达(18±0.5)mm，这时就表明渔线到达了Wistar大鼠MCA的起始端，对MCA的起始端进行结扎阻塞，同时颈内动脉也用渔线进行结扎，完成后一般留出栓线外端1.5 cm左右，最后缝合皮肤。假手术组和吸烟组的Wistar大鼠渔线插入颈内动脉的深度比另外两组浅在15 mm左右。

1.5大鼠神经系统症状观察 观察MCAO模型制备完成后麻醉清醒后(大约4 h)其四肢的反应及活动情况，作为筛选的依据。若不出现前肢伸展无力、行走不稳、倾倒或转圈以及四肢无力无法行走等症状，就要从实验组中排除。

1.6TTC染色 制备筛选大鼠MCAO模型完成4 h，从每组随机选取5只大鼠，利用断头法取出脑组织，将脑干和小脑去除后，放置在0℃的生理盐水中10 min，再取出放置于-20℃的钢板上，由后向前按照2 mm的层厚沿冠状面进行切开，其切片要立即浸泡于含1%TTC的生理盐水中，37℃下孵育30 min。然后再放入固定液(10%的甲醛)中，放置于室温6 h，取出观察。

1.7细胞凋亡的检测 与TTC染色一样，从制备好MCAO模型的每组随机再选取5只大鼠，进行麻醉后，开胸，暴露心脏，找到右心耳剪开一小口，将直径2 mm的胶管从左心室插入，快速灌注生理盐水200 ml，观察到右心耳有透亮液体流出，再用中性甲醛进行灌注固定30 min，然后利用断头法取出脑组织，再用中性甲醛将脑组织固定48 h后，常规行石蜡包埋，自距嗅球尖端7～11 mm处行石蜡切片，切片厚4 μm，行TUNEL染色，应用Quantiment 570C图像分析系统进行观察，400倍镜下每张切片随机10处单位面积内阳性细胞总数，除以10得到的平均数，就是该标本的凋亡细胞数目。

1.8Western印迹检测大鼠脑内Caspase-3原型及活性片段的表达 同样MCAO后4 h，每组大鼠随机选取5只大鼠，麻醉后断头，左右大脑半球距离嗅球尖端7～11 mm处取材。每只大鼠取脑组织50 mg，制成脑组织匀浆，利用Brad-ford法进行蛋白定量分析。 分别从每组大鼠中取100 μg 10%+二苯硫酸钠-聚丙烯酸胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离蛋白，经过转膜和膜封闭后，兔抗大鼠Caspase-3 4℃过夜，相应二抗室温孵育1.5 h，用二氨联苯胺(DAB)辣根过氧化物酶显色试剂盒进行显色，可以观察到特异性抗原条带出现。再用凝胶成像分析系统对每例特异性抗原条带进行定量分析测定，主要是Caspase-3的前体32 kD和切割片段20 kD的目的条带及相应β-actin 的43 kD条带的灰度值。

2 结 果

2.1各组TTC染色结果 各组大鼠脑组织经TTC染色后，观察到缺血梗死区域的组织不染色，呈白色，主要分布在缺血中心区的等值区，分别是矢状裂至外侧裂下几乎2/3的皮质以及距嗅球尖端7～11 mm处；而正常脑组织被染成红色；同时观察到矢状裂至外侧裂上1/3的皮质区内呈现白色向红色的过渡，证实了缺血半暗带主要位于大脑矢状裂至外侧裂上1/3的皮质组织区。

2.2吸烟对Wistar大鼠局灶性脑缺血细胞凋亡的影响 经过TUNEL染色后经Quantiment 570C图像分析系统观察凋亡细胞，染色后阳性细胞核呈现棕黄色或棕褐色。缺血组、假手术组、吸烟组以及吸烟+缺血组的凋亡细胞数分别为17.07±2.92、2.13±0.17、20.65±3.26、44.92±4.67；缺血组、吸烟组以及吸烟+缺血组的凋亡细胞数均比假手术组增加，其中吸烟+缺血组的凋亡细胞数增加更加显著(P<0.05)；同时表明了吸烟和缺血对增加脑细胞的凋亡有协同作用。见图1。

A:假手术组, B:缺血组, C:吸烟组, D:吸烟+缺血组。

2.3各组Caspase-3前体及其切割片段含量的Western印迹检测 假手术组未检测到Caspase-3的前体32 kD和切割片段20 kD的特异性条带；缺血组、吸烟组和吸烟+缺血组均可检测到Caspase-3前体和其切割片段的含量相对灰度值呈平行变化，且在吸烟干预因素协同下缺血后二者表达明显升高(均P<0.05)。见表1，图2。

表1 各组Caspase-3前体及其切割片段含量相对灰度值的比较

A:假手术组, B:缺血组, C:吸烟组, D:吸烟+缺血组

2.4线性相关分析 各组缺血半暗带区内Caspase-3前体32 kD和切割片段20 kD含量的相对灰度值与凋亡细胞数量这3种参数间呈显著性正相关(r=0.902～0.970，P<0.01)。

3 讨 论

近年来有研究表明局灶性脑缺血后神经元的死亡主要表现在缺血中心区神经细胞的坏死和缺血半暗带的神经细胞凋亡〔4〕。相对于缺血中心区发生不可逆损伤的脑组织而言，缺血半暗带的脑组织损伤为可逆性，可以进行修复，因此，人们设想及时采取有效的干预可能会防止缺血半暗带向梗死区进一步发展，主要机制可能是通过抑制神经细胞的凋亡。本实验通过建立短暂性MCAO大鼠模型来分析探讨吸烟对局灶性脑缺血损伤的影响。结果证实吸烟增加大鼠脑缺血半暗带区神经元凋亡数量，且与上调相应区域内Caspase-3表达及活性有关，从而不利于脑缺血半暗带的转归。

吸烟对脑细胞损伤的神经破坏作用机制十分复杂，有研究表明吸烟增加血管内皮细胞黏附介子-1(ICAM-1)损伤，促进动脉硬化改变〔5〕。以往的研究提示吸烟能增加大鼠脑细胞凋亡〔6〕。本试验结果表明了吸烟加重脑缺血损伤可能是通过协同缺血诱导的细胞凋亡机制介导的。

Caspases是细胞凋亡过程中最重要的蛋白酶，凋亡的最后实施是通过Caspases的激活而实现的， Caspase-3作为多种凋亡程序启动最关键的执行蛋白酶，有着非常重要的意义和作用〔7〕，主要是可以诱导细胞的凋亡；尤其在缺血性脑损伤的过程中，抑制Caspase-3的活性可以产生较明显的神经保护作用〔8〕。Caspase-3是Caspases家族重要的成员，细胞内的含量一般比较少，其通常以前体形式存在。研究发现细胞凋亡途径可以诱导上调Caspase-3前体的表达和活化水平〔9,10〕。本研究结果提示吸烟引起鼠脑缺血半暗带区Caspase-3表达及活性异常增加，是缺血半暗带区吸烟引发神经元凋亡的重要分子机制，促使神经元发生进行性损伤，从而加重脑缺血后神经细胞的损伤。

总之，吸烟可以增加MCAO后4 h缺血半暗带区的细胞凋亡，具有神经损伤作用不利于缺血半暗带的转归。吸烟加重脑缺血损伤诱导的细胞凋亡作用可能涉及脑内Caspase-3表达及活性的增加，吸烟上调Caspase-3表达及活性的作用机制尚有待于进一步研究。

4 参考文献

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