阿魏酸钠对脂多糖引起的大鼠海马损伤的保护作用的信号传导机制

闫恩志 范 莹 隋海娟 刘婉珠 刘 卓

(辽宁医学院药理学教研室， 辽宁 锦州 121001)

阿尔茨海默症(AD)具有多重的神经病理学特征，如老年斑、神经纤维缠结和明显的胶质化〔1〕，其发病机制复杂，作用单一靶点的药物很难达到治疗效果。c-Jun氨基末端激酶(JNK)是哺乳动物细胞重要的应激信号传导通路，AD患者脑内JNK信号传导通路的激活已被学者广泛证实〔2〕，近年来体内、体外的研究中发现JNK信号传导通路的激活参与着淀粉样蛋白沉积〔3〕、tau蛋白磷酸化〔4〕和神经细胞凋亡〔5〕，JNK信号传导通路在AD中具有多重靶点的调节作用，因此寻找作用于JNK信号传导通路的特效药物有望在AD治疗中取得突破性进展。阿魏酸钠(SF)具有抗氧化、抗自由基及抗炎等药理作用，研究发现SF能减轻脂多糖诱导的大鼠海马CA1区锥体神经元损伤，改善大鼠的学习记忆障碍，本研究旨在探讨SF是否通过JNK信号传导通路抑制大鼠海马CA1区炎症反应。

1 材料与方法

1.1动物药品和试剂 SD大鼠，雄性，体重220～280 g，动物合格证号：SCXK(辽)2003-0007，由辽宁医学院动物实验中心提供。SF(苏州畅通有限公司，纯度大于99 %)；LPS购于北京邦定泰克生物技术公司(纯度95%)；磷酸化丝裂原激活的蛋白激酶的激酶4(MKK4；Thr261，#9151)，磷酸化JNK1 (Thr183/Tyr185，#9251)，磷酸化c-Jun (Ser63，#9261)，caspase-3(#9662)均为兔抗人多克隆抗体，购于Cell Signaling公司；OX-42为鼠抗人多克隆抗体、FITC标记的山羊抗兔抗体和Cy3标记的山羊抗鼠抗体均购于Santa Cruz生物技术公司；碱性磷酸酶标记的山羊抗兔抗体、β-actin和NBT/BCIP显色液购于碧云天试剂公司。

1.2动物分组及模型建立 SD大鼠随机分为四组，即对照组，LPS模型组，100，200 mg/kg SF组。对照组和模型组分别ig生理盐水1.0 ml，SF组ig不同剂量SF1.0 ml。连续灌胃3 w后，各组大鼠用10%水合氯醛300 mg/kg腹腔麻醉，将大鼠头固定在立体定位仪上，大鼠麻醉固定在立体定位仪上，无菌条件下将5 μl LPS 1.0 mmol/L恒速注射到左侧脑室内，正常对照组注射等量的生理盐水。

1.3Western 蛋白印迹检测磷酸化的MKK4、磷酸化JNK1、磷酸化c-Jun和caspase-3蛋白表达水平 大鼠麻醉，快速取海马CA1区，按前述方法进行磷酸化蛋白测定〔6〕，简言之，SDS-PAGE电泳后转膜，加入一抗4℃过夜，二抗孵育2 h(所有抗体均1∶500稀释)，避光显色，利用凝胶自动分析成像软件Chem Image 5500对蛋白带进行灰度值分析。

1.4激光共聚焦显微镜观察磷酸化JNK1在小胶质细胞表达部位 制备鼠脑石蜡切片，按前述方法进行p-JNK和OX-42荧光免疫组织化学双染〔6〕，水溶性封片剂封片，共聚焦显微镜下观察，其中绿色荧光的分布和强度反映JNK的定位和表达强度，红色荧光则反映代表小胶质细胞的小胶质细胞特异表达补体C3受体单克隆抗体(OX-42)的表达情况。

1.5统计学处理 采用SPSS11.5软件包进行ANOVA和LSD′s post hoc test检验。

2 结 果

2.1SF对LPS引起的大鼠海马CA1区磷酸化MKK4表达水平的影响 侧脑室注射LPS后,大鼠海马CA1区磷酸化MKK4蛋白表达水平较生理盐水对照组明显增加。 SF(100，200 mg/kg)可明显对抗LPS引起的磷酸化MKK4蛋白表达水平增加(表1)。

2.2阿魏酸钠对LPS引起的大鼠海马CA1区磷酸化JNK1表达水平的影响 侧脑室注射LPS 1 w后,大鼠海马CA1区磷酸化JNK1蛋白表达水平较生理盐水对照组明显增加。SF(100，200 mg/kg)可明显对抗LPS引起的磷酸化JNK1蛋白表达水平增加(图1和表1)。激光共聚焦显微镜进行观察，磷酸化的JNK表达与表示小胶质细胞的OX-42基本重叠(黄色)，说明磷酸化的JNK主要在小胶质细胞内表达(图2，表1)。

2.3阿魏酸钠对LPS引起的大鼠海马CA1区磷酸化c-Jun表达水平的影响 侧脑室注射LPS 1 w后,大鼠海马CA1区磷酸化c-Jun蛋白表达水平较生理盐水对照组明显增加。 SF(100，200 mg/kg)可明显对抗LPS引起的磷酸化c-Jun蛋白表达水平增加(P<0.05)(图3和表1)。

2.4阿魏酸钠对LPS引起的大鼠海马CA1区caspase-3蛋白表达水平的影响 侧脑室注射LPS 1 w后,大鼠海马CA1区caspase-3蛋白表达水平较生理盐水对照组明显增加，SF(100，200 mg/kg)可明显对抗LPS引起的caspase-3蛋白表达水平增加(图4和表1)。

表1 SF对LPS引起的大鼠海马CA1区p-MKK4、p-JNK1、p-c-Jun和caspase-3蛋白表达灰度值分析结果

1.对照组；2.模型组；3.SF 100 mg/kg组；4.SF 200 mg/kg组

图2 激光共聚焦显微镜定位大鼠海马CA1区磷酸化JNK和OX-42在小胶质细胞表达

1.对照组；2.模型组；3.SF 100 mg/kg组；4.SF 200 mg/kg组

1.对照组；2.模型组；3.SF 100 mg/kg组；4.SF 200 mg/kg组

3 讨 论

本研究发现脑室注射LPS后大鼠海马CA1区磷酸化JNK，c-Jun表达增加，同时JNK通路上游磷酸化MKK4表达也明显增加，激光共聚焦显示JNK的表达部位主要是在小胶质细胞，说明JNK通路在小胶质细胞活化介导的神经细胞凋亡中可能起着主要作用。MKK4在上游激酶作用下激活，活化的MKK4进一步磷酸化JNK分子的丝氨酸残基位点，活化JNK〔7〕。JNK是位于胞质分子量为54KU的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,它的双磷酸化功能区Thr-Pro-Tyr与c-Jun N端的活化区结合并使其第63、73位丝氨酸残基磷酸化从而使其活化并转移到细胞核，引起级联反应，导致其一些底物相应激活〔8，9〕。JNK激活后可通过两种途径发挥作用，一是上调促凋亡相关蛋白的表达：JNK通过磷酸化c-Jun，活化的c-Jun可以聚合成类二聚体或与c-Fos 聚合成异二聚体，形成活化蛋白-1(AP-1)复合物，使c-Jun转录活性增强〔10〕，促进肿瘤坏死因子(TNF)α、白细胞介素(IL)-1β、iNOS、COX-2等炎症因子表达〔11，12〕。另一方面是参与线粒体介导的细胞凋亡通路，通过改变线粒体通透性转换孔的通透性释放细胞色素C，进而活化促凋亡因子Apaf-1，促发caspase-9，caspase-3级联反应，Caspase-3 是caspase家族的重要成员之一，是凋亡执行的最终效应因子，活化的caspase-3可以裂解很多靶蛋白，使细胞内一些重要的生理过程发生障碍、细胞器的一些结构成分崩解。本研究也发现LPS在上调JNK通路的同时也促进了磷酸化的caspase-3蛋白表达，而SF不仅能明显抑制LPS引起的磷酸化MKK4，JNK，c-Jun表达增加，也能明显抑制caspase-3蛋白表达增加，提示SF可能通过抑制JNK信号传导通路起到抗细胞凋亡的作用。

JNK信号传导通路除了参与AD脑内的炎症病变，还参与老年斑及神经纤维缠结的形成〔13〕，有研究显示神经纤维缠结的形成过程与AD患者的痴呆严重程度相关，我们的实验仅证明了SF通过抑制JNK信号传导通路抗细胞凋亡的作用，SF是否还存在其他抗AD作用机制还需进一步研究。

4 参考文献

1Silverman W，Wisniewski HM，Bobinski M,etal.Frequency of stages of Alzheimer-related lesions in different age categories〔J〕.Neurobiol Aging,1997；18(4):377-9.

2Savage MJ,Lin YG,Ciallella JR,etal.Activation of c-Jun N-terminal kinase and p38 in an Alzheimer′s disease model is associated with amyloid deposition〔J〕.Neurosci，2002；22(9):3376-85.

3Dhanasekaran DN，Reddy EP.JNK signaling in apoptosis〔J〕.Oncogene，2008；27(48)：6245-51.

4Reynolds CH，Utton MA，Gibb GM,etal.Stress-activated protein kinase/c-jun N-terminal kinase phosphorylates tau protein〔J〕.J Neurochem,1997；68(4):1736-44.

5Colombo A，Bastone A，Ploia C,etal.JNK regulates APP cleavage and degradation in a model of Alzheimer′s disease〔J〕.Neurobiol Dis，2009；33(3):518-25.

6闫恩志，范 莹，金 英.吡格列酮对淀粉样 蛋白片段1-42引起的大鼠海马c-Jun氨基端激酶信号传导通路改变的作用〔J〕.中国药理学与毒理学杂志，2010；24(6):174-9.

7Ho DT，Bardwell AJ，Grewal S,etal.Interacting JNK-docking sites in MKK7 promote binding and activation of JNK mitogen-activated protein kinases〔J〕.J Biol Chem，2006；281(19):13169-79.

8Dérijard B，HibI M，Wu IH,etal.JNK1：a protein kinase stimulated by UV light and Ha-Ras that binds and phosphorylates the c-Jun activation domain〔J〕.Cell，1994；76(6):1025-37.

9Baltriukiene D，Kalvelyte A，Bukelskiene V.Induction of apoptosis and activation of JNK and p38 MAPK pathways in deoxynivalenol-treated cell lines〔J〕.Altern Lab Anim，2007；35(1):53-9.

10Halazonetis TD，Georgopoulos K，Greenberg ME,etal.c-Jun dimerizes with itself and with c-Fos，forming complexes of different DNA binding affinities〔J〕.Cell,1998；55(5):917-24.

11Pan XD，Chen XC，Zhu YG,etal.Tripchlorolide protects neuronal cells from microglia-mediated beta-amyloid neurotoxicity through inhibiting NF-kappaB and JNK signaling〔J〕.Glia,2009；57(11):1227-38.

12Bodles AM，Barger SW.Secreted beta-amyloid precursor protein activates microglia via JNK and p38-MAPK〔J〕.Neurobiol Aging,2005；26(1):9-16.

13Steven P，Braithwaite SP，Ralf S,etal.Inhibition of c-Jun kinase provides neuroprotection in a model of Alzheimer′s disease〔J〕.Neurobiol Dis,2010；39:311-7.