外源性H2S对肺纤维化大鼠肺组织转化生长因子-β1及结缔组织生长因子的干预作用

曹 华 马红英 曹 霞 黄新莉 张雪静 周晓红

(河北中医学院基础医学院，河北 石家庄 050091)

近年来肺纤维化的发病呈上升趋势，但其发病机制尚未完全明确，临床上缺乏有效的治疗方案，预后较差。前期实验结果表明内源性硫化氢(H2S)的减少参与了脂多糖所致大鼠急性肺损伤的发病，而一定量的外源性H2S可通过本身的抗炎、抗氧化作用以及下调NO/iNOS体系、上调 CO/HO-1体系发挥一定的抗损伤作用〔1〕。本实验观察羟脯氨酸(HYP)、转化生长因子(TGF)-β1及结缔组织生长因子(CTGF)在大鼠肺纤维化过程中各个时期的表达情况，并研究外源性H2S对大鼠肺纤维化的干预作用。

1 材料与方法

1.1材料 博莱霉素(BLM)A5购自天津太河制药有限公司，羟脯氨酸(HYP)检测试剂盒购自南京建成生物技术有限公司，TGF-β1及CTGF免疫组化试剂盒均购自武汉博士德生物有限公司。

1.2大鼠肺纤维化模型制备 根据文献〔2〕，以10%的水合氯醛(10 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，将其仰卧固定于大鼠实验台上，无菌条件下行颈部正中切口，逐层分离，暴露气管，对照组一次性气管内注入生理盐水1 ml/kg，其余组一次性气管内注入等体积BLM 5 mg/kg，注射后即将动物直立并旋转，使药物在肺内均匀分布，尔后缝合皮肤，置于实验动物室内喂养。

1.3动物分组和给药 清洁级健康雄性Wistar大鼠54只，体重230～250 g，购自河北医科大学实验动物中心。大鼠适应性喂养1 w后，随机分为3组，每组18只。对照组、肺纤维化组和NaHS(H2S供体)+肺纤维化组。造模后第2天开始：NaHS+肺纤维化组每天腹腔注射0.5 ml NaHS(28 μmol/kg)，对照组及肺纤维化组每天腹腔内注射等量生理盐水。

1.4标本制备 各组在给药后7、14、28 d分别随机从颈动脉放血处死6只，留取左肺组织，以体积分数10%中性甲醛溶液固定，供免疫组化用。取右肺组织100 mg制备10%肺组织匀浆，-70℃保存，用以检测HYP含量。

1.5指标检测

1.5.1肺组织HYP含量的检测 采用碱水解法，通过721分光光度计比色法测得，结果以每克肺组织中HYP的质量表示。

1.5.2肺组织TGF-β1及CTGF蛋白测定 严格按照免疫组化染色试剂盒说明书进行。于普通光镜下观察，胞质呈清晰棕色为阳性，采用美国Image-Pro Plus专业图像分析系统，每张切片随机选取10个高倍视野，自动选取阳性区域并计算平均光密度值(A)。

2 结 果

2.1肺组织HYP含量的比较 与对照组相比，肺纤维化组大鼠肺组织HYP 7 d时开始升高，且在 14、28 d继续升高(P<0.01)；与肺纤维化组相比，NaHS+肺纤维化各组肺组织HYP在各期均显著降低(P<0.01)，但各期HYP含量均高于同期对照组(P<0.05、0.01)，见表1。

2.2肺组织TGF-β1蛋白表达比较 TGF-β1在对照组大鼠肺组织内广泛表达于气管上皮细胞、血管内皮细胞、肺泡巨噬细胞等各种组织细胞及肺间质内。灌注BLM后TGF-β1表达增强，7 d达到高峰，以后表达逐渐降低，28 d表达仍高于对照组(P<0.01)。外源性H2S治疗后各时间点TGF-β1表达均较同期肺纤维化组减少(P<0.01)，但仍高于同期对照组(P<0.01)，见表2。

表1 三组大鼠各期HYP含量比较

表2 三组大鼠各时期肺组织中TGF-β1蛋白含量的比较(A值)

2.3肺组织CTGF蛋白表达比较 对照组CTGF阳性表达较少，主要表达于气管上皮细胞的胞质，肺间质细胞未见表达。 肺纤维化组，CTGF同时也在肺泡上皮细胞、巨噬细胞胞质、成纤维细胞表达，阳性表达较对照组明显升高，7 d达到高峰，以后表达逐渐降低，28 d表达仍高于对照组(P<0.01)。NaHS+肺纤维化组中各期CTGF阳性表达均较肺纤维化组明显减少，但仍高于同期对照组(P<0.01)，见表3。

表3 三组大鼠各时期肺组织中CTGF蛋白含量的比较(A值)

2.5相关分析 将各组各时期TGF-β1与CTGF进行相关分析，结果显示二者均呈显著正相关(r=0.891～0.968，P均<0.01)。

3 讨 论

肺纤维化是多种原因导致的严重肺损伤的共同结局，主要病理特点是早期的弥漫性肺泡炎和晚期大量成纤维细胞病理性增生及基质胶原进行性积聚并取代正常的肺组织结构。是一种难治的肺部疾病，目前公认疗效确切的糖皮质激素，在肺泡炎期奏效，但在广泛肺纤维化期则难有改观，由于其副作用大〔3〕，且糖皮质激素治疗不能改变肺纤维化患者的生存期〔4〕，故其应用有一定局限性。BLM是临床常用的一种抗肿瘤药物，其主要的毒副作用之一是引起肺纤维化，用其复制动物肺纤维化模型，已成为国内外公认的成熟方法〔5〕。近年来，H2S作为体内气体信号分子逐渐成为大家关注的焦点，虽然高浓度H2S对于机体是有害的，但是低浓度H2S却在机体内发挥着重要的生理功能，大量体内及体外实验证实H2S具有抗氧化、抑制炎症因子释放、抗增殖、抗凋亡、调节血管张力等生物学作用〔6〕。在本实验中，应用NaHS作为外源性H2S来源，进一步观察外源性H2S对于BLM致大鼠肺纤维化的作用机制。

HYP是胶原蛋白的主要成分之一，HYP含量的测定可以间接反映胶原含量，因此，测定HYP的含量常被用于肺纤维化的研究〔7〕。本实验研究提示肺纤维化模型复制成功；在大鼠肺纤维化的各个时期，应用NaHS可通过参与调节肺组织中胶原的代谢，减轻胶原在肺间质中的沉积，明显改善肺组织病理变化，延缓肺纤维化发生与发展。

大多数学者认为，细胞因子网络在介导炎症及肺纤维化过程中发挥着举足轻重的作用。在启动和调控纤维化的细胞因子网络中，TGF-β1是最重要的细胞因子，其中以TGF-β1所占比例最高、活性最强。TGF-β1通过胞内信号分子蛋白转导信号，趋化并促进成纤维细胞分裂增殖及成熟分化，刺激成纤维细胞大量合成I、Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白，尤其是Ⅳ型胶原蛋白，以增加肺间质的胶原成分，同时TGF-β1可抑制胶原蛋白酶及纤溶酶原激活物的合成，增加蛋白酶抑制物的形成，以减少肺间质细胞外基质的降解，促进细胞外基质沉积，是组织纤维化过程中始发的致纤维化因子。但TGF-β1的单独作用并不能引起纤维化，事实上，TGF-β1促进脏器纤维化的信号是通过CTGF向下转导的〔8〕。CTGF是介导TGF-β1促纤维化作用的一个重要的下游因子，应用反义CTGF技术或抗CTGF中和抗体可以阻断TGF-β1引起的促纤维化效应〔9〕。还有研究发现在小鼠的皮肤纤维化模型中，TGF-β1可以引起短期的纤维化组织增生，而同时注射CTGF则可以引起持续稳固的纤维组织增生〔10〕。本实验肺组织免疫组化结果表明，灌注 BLM后各期大鼠肺组织TGF-β1及CTGF蛋白表达均显著升高；给予NaHS治疗后TGF-β1及CTGF蛋白表达在各期均显著降低，相关性分析显示，各组各期TGF-β1与CTGF呈显著正相关，提示外源性H2S可以抑制TGF-β1信号通路，减少其下游调控因子CTGF蛋白表达，发挥其抗纤维化作用。

总之，本文表明外源性H2S可以通过抑制TGF-β1信号通路，下调CTGF蛋白表达发挥抗纤维化作用，其具体机制有待进一步研究。

4 参考文献

1周晓红，黄新莉，曹 华，等.硫化氢在脂多糖所致老年大鼠急性肺损伤中的作用〔J〕.中国老年学杂志,2009;29(21)：2764-7.

2Szapiel SV，Elson NA，Fulmer JD,etal.Bleomycin-induced interstitial pulmonary disease in the nude， athymic mouse 〔J〕.Am Rev Respir Dis，1979;120(4)：893-9.

3Gribbin J，Hubbard RB，Le Jeune I，etal.Incidence and mortality of idiopathic pulmonary fibrosis and sarcoidosis in the UK〔J〕.Thorax，2006;61(11)：980-5.

4佘巍巍，杨新官.糖皮质激素治疗与特发性肺纤维化患者生存期的相关性〔J〕.中国老年学杂志,2010;30(21)：3173-4.

5金晓光，代华平，庞宝森，等.博莱霉素致大鼠肺纤维化模型肺组织的动态病理变化及其发生机制〔J〕.中国病理生理杂志,2009;25(4)：708-14.

6房立平，唐朝枢，刘新民.内源性气体信号分子和调节肽在特发性肺纤维化发病中的作用〔J〕.国际病理科学与临床杂志,2009;29(1)：10-4.

7Wang X，Wu G，Gou L,etal.A novel single-chain-Fv antibody against connective tissue growth factor attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice〔J〕.Respirology，2011;16(3)：500-7.

8Jiang C，Huang H，Liu J,etal.Fasudil，a rho-kinase inhibitor，attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice〔J〕.Int J Mol Sci，2012;13(7):8293-307.

9Crean JK，Finlay D，Murphy M,etal.The role of p42/44 MAPK and protein kinase B in connective tissue growth factor induced extracelluar matrix protein Production，cell migration，and action cytoskeletal rearrangement in human mesangial cells〔J〕.J Biol Chem，2002;277 (46)：44187-94.

10Mori T，Kawara S，Shinozaki M,etal.Role and interaction of connective tissue growth factor with transforming growth factor-beta in persistent fibrosis：a mouse fibrosis model〔J〕.J Cell Physiol，1999;181(1)：153-9.