按摩对兔骨骼肌钝挫伤炎症及血液机制的影响

刘仁建 唐成林 邹 敏 郜 婕 谢 辉 唐 曦

(重庆医科大学中医药学院中医药研究室，重庆 400016)

中医推拿属于中医外治法范畴，是祖国医学的重要组成部分，具有副作用小、经济简便、疗效显著的特点〔1〕，但一直没有形成完整的理论体系，理论基础还比较薄弱。其论述多散在于各种医籍及综合性古籍之中〔2〕。笔者前期研究发现按摩可延缓或阻止骨骼肌和运动终板的损伤，可促进兔损伤股四头肌的组织形态及细胞骨架恢复，可能与上调结蛋白(Desmin)和α-肌动蛋白(α-Actin) 表达及促进受损肌组织有氧代谢相关酶类活性有关〔3，4〕。骨骼肌急性损伤后，首先在损伤的局部出现肌纤维结构破坏、变性和坏死，之后炎症细胞和致炎因子浸润至损伤的部位。炎症因子在损伤部位发挥着双重作用，一方面吞噬坏死细胞和损伤的细胞碎片，另一方面通过分泌生长因子激活肌卫星细胞，使其增殖形成新的肌管细胞进而发育成肌纤维，修复损伤的肌纤维，完成肌肉的再生过程。而中医认为按摩能帮助重建体内经气的正常疏通，经气通，气血调，痛止，淤消，使受伤区域气血通调，淤血消散而脉络通，进而达到解痉止痛、消肿、促进肌肉功能恢复的目的。本实验拟探讨推拿促进肌肉损伤修复的作用机制 。

1 材料与方法

1.1实验材料 选取健康成年雄性新西兰大白兔40只，体重(2.0±0.5)kg，由重庆医科大学实验动物中心提供(医学动物合格证SCXK渝20070002)。兔PGE2、IL-6、CRP ELISA试剂盒(R&D公司分装)；酶标仪(BIOCELL，中国)；MVIS-2022全自动血流变分析仪(重庆天海医疗设备有限公司)，荷兰飞利浦公司产飞利浦iu22高端彩超诊断仪(L12-5 高频探头，频率10 MHz)。

1.2实验动物分组及制模 上述40只实验兔均分笼饲养(室温25℃)，经适应性喂养7 d后采用简单随机抽样法将实验兔分为4 组，空白对照组(A 组，n=4)、按摩前对照组(B组，n=4)、自然恢复组(C组，n=16)和按摩组(D组，n=16)，C、D 组又分为制模后7 d、11 d、15 d、19 d四个亚组(各4只)。A 组实验动物不作任何处理，作为正常对照；B、C 、D组实验动物用自制打击器制备兔右后肢股四头肌损伤模型。D 组于造模后第5天开始按摩〔5〕， C 组不予按摩。

于制模前1 d采用8%硫化钠脱毛剂去除各组实验兔后腿被毛，采用自制重力铅锤打击兔右后肢股四头肌肌腹中段以建立股四头肌损伤模型。具体制模过程如下：将家兔仰卧位固定，于右后肢打击部位垫一层纱布防止皮肤损伤；采用自制重力铅锤(锤长10 cm，重0.5 kg，底面平滑，直径2.5 cm)沿PVC硬塑料导向管(长100 cm，直径3.0 cm)自70 cm高处自由下落，同一部位连续打击3次，重力铅锤的投放和塑料导向管的固定每次均由同一人操作，以保证撞击力和损伤范围的一致性。肉眼可见打击部位出现肿胀和淤血，类似肌肉受撞击损伤，打击后无骨折，无皮肤破裂，表明模型建立成功〔3，4〕。造模后放回笼中常规饲养。

1.3按摩干预 按摩组于造模后第5天开始按摩治疗。将实验兔置于兔盒内以侧卧位方式固定，将天津产AFY-10型按摩器固定于受损部位附近，对受损股四头肌及邻近肌组织进行按摩，按摩转速为2 600 r/min，按摩时间15 min，每天1次。

1.4组织样本取材和预处理 空白对照组于制模前1 d，按摩前对照组于制模后第3天,自然恢复组与按摩组于制模后第7、11、15及19天时各选出4只实验兔取血液样本。具体方法：用兔盒将兔仰位固定，选择心脏跳动最明显处进行穿刺，部位是第3肋间隙胸骨左缘3 mm处，抽取3 ml血置于5 ml肝素抗凝管内，送学校中心实验室做血流变测定；另抽取3 ml血放于洁净试管中，室温自然凝固15 min，离心20 min(3 000 r/min)，仔细收集上清，然后分装于0.5 ml 的EP管中，放置于-20℃的低温冰箱中保存,集中进行血清IL-6、前列腺素E2(PGE2)、C反应蛋白(CRP)指标检测。

1.5ELISA 检测组织中IL-6、PGE2、CRP 的含量 按照ELISA 试剂盒说明书进行操作。稀释标准品，设置空白对照孔和待测样品孔，37℃温育30 min，用配液洗涤5 次；加酶标试剂(空白孔除外)后37℃温育30 min，洗涤5 次；每孔加入显色剂，37℃避光显色15 min；每孔加终止液，终止反应。测定：以空白孔调零，用酶标仪在450 nm波长下依序测量各孔的吸光度(OD 值)，测定应在加终止液后15 min以内进行。通过标准曲线计算血清样品中兔IL-6、PGE2、CRP的含量。

1.6组织学观察 4%多聚甲醛固定液中固定4 h 后取出股四头肌标本，常规乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，片厚5 μm。取其中一部分切片常规法行HE 染色。100倍光镜下观察切片病理结构后，200 倍光镜下对目标位点照相、至少记录5 个不同视野。超声微泡检查：兔经耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠(25 mg/kg) 行全身麻醉，8%的硫化钠脱毛，胶布固定于实验台上。造影剂于使用前注入3 ml双蒸水，迅速振摇至其完全溶解，耳缘静脉注射，即刻用飞利浦iu22高端彩超诊断仪对受损股四头肌进行局部超声诊断，观察并记录图像。

2 结 果

2.1按摩对炎症因子的影响 见表1。按摩前对照组(B)PGE2含量较空白对照组显著增高(P<0.01)；经过按摩干预后，损伤后7、11、15、19 d按摩组(D)PGE2水平较自然恢复组(C)均显著降低(t=3.477 0，P<0.05；t=6.740 8，t= 10.910 6，t=7.395 2，P<0.01)。正常白兔PGE2处于较低水平，损伤后迅速升高，到5 d左右达到峰值，而后开始下降；而按摩组经过按摩干预后，PGE2水平较对照组下降明显加快(P<0.01)。

表1 不同时段PGE2、IL-6、CRP的变化

按摩前对照组(B)IL-6含量较空白对照组显著增高(P<0.01)；经过按摩干预后，损伤后7 d，按摩组(D) IL-6水平较自然恢复组(C)偏高(t=3.057 3，P<0.05)；损伤后11 d，按摩组(D) IL-6水平较自然恢复组(C)差异无统计学意义(t=2.240 4，P>0.05)；损伤后15、19 d按摩组(D) IL-6水平显著低于自然恢复组(C)(t=6.205 9，t=10.364 7，P<0.01)。正常白兔IL-6处于较低水平，损伤后迅速升高，到7 d左右达到峰值，而后开始下降；而按摩组经过按摩干预后，IL-6水平在7 d左右较对照组偏高(P<0.05)，而二者在下降过程中按摩组较对照组下降明显加快(P<0.01)。

按摩前对照组(B)CRP含量较空白对照组显著增高(P<0.01)；经过按摩干预后，损伤后7 d，按摩组(D) CRP水平较自然恢复组(C)差异无统计学意义(t=0.711 1，P>0.05)；损伤后11、15、19 d，按摩组(D) CRP水平较自然恢复组(C)显著降低(t=5.760 5，t=10.306 3，t=4.721 2，P<0.01)。正常白兔CRP处于较低水平，损伤后迅速升高，到5 d左右达到峰值，而后开始下降；而按摩组经过按摩干预后，在下降过程中实验组较对照组下降明显加快，且差异具有显著性(P<0.01)。

2.2按摩对血液流变的影响 见表2。按摩前对照组(B)全血黏度、血浆黏度均明显大于空白对照组(A)，表明急性软组织损伤时血液流变学呈明显改变,表现为“浓、黏、凝、聚”状态。而随着恢复时间的变化，全血黏度与血浆黏度均有所降低，同时间段，按摩组(D) 全血黏度与血浆黏度均较自然恢复组(C)低，到19 d左右已恢复到正常水平，与空白对照组(A)比较无显著差异(P>0.05)。而对照组(C)19 d时，虽有所好转，但较空白组仍然有显著差异(P<0.01)。

2.3组织学观察 制模后第7天自然恢复组(A)可见肌纤维明显萎缩、坏死，肌纤维间隙变宽，退变的肌纤维横截面积明显变小，炎症反应强烈；按摩组(B)亦可见肌纤维明显萎缩、坏死，肌纤维间隙变宽及强烈炎症反应，但可见明显的新生血管生成。制模后第15天自然恢复组(C)可见肌纤维明显恢复，但恢复的肌纤维较按摩组横截面积较小且排列紊乱，肌纤维间可见明显的结缔组织填充；按摩组可见肌纤维排列紧密整齐，肌纤维横截面积明显较自然恢复组大，已于正常肌组织无明显差别。见图1。

超声微泡结果显示，制模后第7天自然恢复组(A)可见较大范围的坏死组织，超声微泡显示坏死组织内无血液供应，无血管生成；按摩组(B)显示坏死范围较自然恢复组小，且坏死组织内部有部分微泡，表明坏死组织内部有部分血管生成，且坏死组织周围微泡密度，亮度均较自然恢复组高，表明按摩组血供情况明显优于自然恢复组。制模后第15天自然恢复组(C)可见血液供应情况仍然不佳，坏死范围虽明显减少，但与按摩组仍有较大差别；按摩组(D)可见血供情况良好，只有微小的坏死组织，恢复情况明显优于自然恢复组。见图2。

表2 损伤后不同时段血液流变学改变

图1 股四头肌组织学观察(HE，× 200)

图2 股四头肌超声微泡观察

3 讨 论

笔者利用新西兰大白兔股四头肌损伤模型，研究了按摩对受损肌组织病理修复及其对炎症因子IL-6、PGE2、CRP及血液流变学的影响。结果表明，按摩有利于骨骼肌损伤组织的修复，可以有效减轻炎症反应，改善血液“浓、黏、凝、聚”的状态。

研究表明，在骨骼肌损伤的早期，由损伤肌肉释放的炎症因子向外周血的炎症细胞提供趋化信息〔6〕，趋化物质多为肽、蛋白质或蛋白质碎片，这些物质以其浓度的梯度诱导以中性粒细胞和巨噬细胞为主要的炎症细胞向趋化物质处移动，并产生高水平的炎症细胞因子。这些细胞因子导致了持久的炎症过程，并参与了疼痛的传输和维持〔7〕。这些细胞因子一方面促进受损组织的修复，另一方面又产生了红、肿、热、痛等作用〔8〕。炎症细胞的主要作用在于释放蛋白水解酶，降解在肌肉损伤中产生的细胞碎片，并且也可以释放高浓度的细胞溶解物和细胞毒素及抗癌分子可损害肌肉或其相临未损伤的肌肉组织〔9〕。

PGE2是多种致热原引起发热的发热中枢正调节介质〔10〕，中枢内的PGE2在受体EP的介导下，通过复杂的细胞信号转导引起体温调节中枢调定点的上移，导致发热〔11〕。在炎症的局部区域，PGE2还能降低痛阈同时激活存在于外周感觉神经末梢的EP受体，敏化外周痛觉感受器〔12，13〕。本实验结果表明损伤后机体处于炎症状态，而后PGE2水平开始下降，表明随着损伤的修复炎症正在减轻；而按摩能显著抑制兔子急性软组织损伤后受伤局部PGE2含量的升高，有利于减轻炎症反应及其引起的水肿、发热和疼痛。

IL- 6在感染和损伤引起的炎症和免疫反应介导的过程中起重要作用〔14〕，病毒、细菌感染均能诱导体内IL-6表达增加〔15〕，其本身对细胞无直接损害作用，是敏感反映机体炎症与组织损伤严重程度的重要指标〔16〕。CRP是急性时相蛋白中变化最显著的一种， 是组织损伤时血浆中快速升高的主要急性期蛋白之一〔17〕，也是第一个被发现的急性期反应蛋白〔18〕。CRP是血浆蛋白的一种正常成分，主要由肝细胞合成和分泌〔19〕，在正常人血清中含量极微，在炎症或组织损伤时会升高，而在疾病得到缓解时又能迅速恢复正常〔20〕。检测CRP对于疾病的诊断虽无特异性，但其浓度上升是多种原因引起的炎症或组织损伤的超敏指标，是判断健康或疾病的重要提示〔21〕。IL-6作为一个抗炎性细胞因子，主要作用是抗炎症作用〔22〕，CRP作为主要的急性时相反应蛋白，是一种敏感的炎症标志物〔23〕。本实验表明损伤后机体处于强烈的炎症反应阶段。IL-6可诱导肝细胞产生急性期血浆蛋白以补充IL-1和肿瘤坏死因子(TNF)诱导肝细胞产生的血浆蛋白，如CRP、血清淀粉样A蛋白、α酸性糖蛋白和某些补体成分，有利于机体抵御病源微生物〔24〕，推测按摩可能通过早期增加IL-6含量已达到更好的抗炎症作用，本文显示随着机体炎症与组织损伤严重程度减轻，IL-6水平正在逐渐下降。按摩可以有效减轻损伤后机体炎症，减轻过度炎症对机体的损害，有利于损伤组织的恢复。

急性软组织损伤属中医学“筋伤” 范畴，祖国医学认为急性伤筋以后血离经脉，经络受阻，瘀血不散，气血流行不通，“不通则痛”。《灵枢.经脉篇》“脉不通，脉不通则血不流”。中医学认为，急性软组织损伤多因急性跌、打、扭、挫等外力作用而引起筋肉、脉络损伤，血溢脉外所致，主要病机是气滞血瘀、脉络不通，治当活血化瘀、消肿通络、行气止痛。已有研究表明，动物急性软组织损伤时血液流变学呈明显改变，表现为“浓、黏、凝、聚”状态〔25〕。因而在治疗时必须使经络运行畅通，局部瘀血活散，受伤组织得以气血濡养，通则不痛。本实验发现，按摩可以有效改变血流状态，可减轻血液黏度，加快血液流动，有利于血液向损伤区域流动，为损伤区域提供丰富血供，有利于坏死区血管生成，减轻局部坏死，同时为组织细胞提供更多的血氧，有利于局部内环境的改善，减少代谢紊乱，减少了组织细胞的变性坏死。

推拿按摩是祖国医学的特色疗法，具有简、便、验、廉等特点。《医宗金鉴·正骨心法要旨》指出：“按其经络，以通郁闭之气，摩其雍聚，以散淤结之肿，其患可愈”。《内经》的《素问·血气形志篇》说:“形数惊恐，经络不通，病生于不仁，治之以按摩醪药”。祖国医学认为其作用主要是平衡阴阳、调和气血、疏通经络、滑利关节，得以使“骨正筋柔、气血以流”〔26〕。本实验证实，按摩可有效防止肌细胞的萎缩、退变及坏死，促进血管生成，减少结缔组织生成并使肌纤维的排列更加有序，还能调节炎症因子，改善血液流变学的状态，可有效减轻炎症加重血液流变学异常，而血液流变学异常又加重炎症的恶性循环，从而达“到祛瘀生新”，“通则不痛”的目的，为按摩对肌肉损伤修复机制的探讨提供了新的实验依据。

4 参考文献

1廖 军，王诗忠，徐 腾.关于推拿教学改革的思考〔J〕.四川教育学院学报，2008； 24(6):29-30.

2薛卫国.对中医现代化的思考〔J〕.按摩与导引，2000；16(6)：2-3.

3侯懿烜,柳满然,余 敏,等.按摩促进兔股四头肌损伤修复的体内研究〔J〕.中国修复重建外科杂志，2012；26(3):347-52.

4侯懿烜,郑元义,张 萍,等.按摩增强琥珀酸脱氢酶和钾-钠ATP 酶活性促进兔股四头肌的损伤修复〔J〕.第三军医大学学报,2012；33(19):2012-5.

5石葛明,王学理,李桂桐,等.按摩对肌肉损伤修复作用的形态学研究〔J〕.中国运动医学杂志，1991；10(4):201-4.

6Qu-Petersen Z,Deasy B,Jankowski R,etal.Identification of a novel population of muscle stem cells in mice：potential for muscle regeneration〔J〕. J Cell Biol,2002；157：851-64.

7Manjavachi MN，Motta EM，Marotta DM，etal.Mechanisms involved in IL-6-induced muscular mechanical hyperalgesia in mice〔J〕.Pain，2010；151:345-55.

8杨雅丽,郑宝森,李清敏,等.红光治疗对大鼠局部损伤组织中细胞因子IL-1β和PGE2的影响〔J〕.中国疼痛医学杂志,2012；18(2):108-12.

9Tiidus PM.Radical species in inflammation and overtraining〔J〕.J Physiol Pharmacol,1998；76:533-8.

10陆大祥.发热〔M〕. 王迪寻,金惠铭.人体病理生理学〔M〕.北京:人民卫生出版社,2002.361-74.

11欧阳娟,吴小云,谢新华,前列腺素E2及其受体与发热机制的研究进展〔J〕.广东医学,2008；29(8):1420-1.

12Omote K,Kawamata T,Nakayama Y,etal.Effects of a novel selective agonist for prostaglandin receptor subtype EP4 on hyperalgesia and inflammation in monoarthritic model〔J〕.Anesthesiology,2002;97:170-6.

13吕 牮,李佳睿,刘 铜.PGE2及其EP3受体在PAG脑区参与炎性疼痛的调节〔J〕.中国老年学杂志,2008；28(2)：126-8.

14刘玉倩,王海涛,赵 斌,等.不同强度运动对大鼠肝hepcidin mRNA表达和血清IL-6、铜蓝蛋白(CP) 含量的影响〔J〕.体育科学，2009；29(5):66-9.

15Luppi P,Licata A,Haluszczak C,etal.Analysis of TCR Vbetarepertoire and cytokine gene expression in patients with idiopathic dilated cardio myopathy〔J〕.J Autoimmun,2011；16(1):3-13.

16邓志荣,连俊峰,杨 乐.下肢严重刨伤患者血清 TNF-α 及IL-6 的表达及其临床伤情判断价值〔J〕.临床医学工程,2010；17(8)：79-80.

17Xaso K，Schwab C，Mc Geer EG.Generation of Creactive protein and compleent components in a therosclerotic plaques〔J〕.Am Pathol，2001；158(3)：1039-52.

18Du C los TW.C-reactive protein as a regulator of autoimmunity and in- flammation〔J〕.Arthritis Rheum，2003；48:1475-7.

19喻少波,王晋平,居 军.超敏C反应蛋白与类风湿关节炎、骨关节炎关系的探讨〔J〕.临床荟萃,2007；22(3):181.

20章谷生.将CRP的实验室数据更好地转化为临床可用的信息〔J〕.上海医学检验杂志,1999；14(5):257.

21王生忠,王佑清,喻 飞,等.C-反应蛋白检测对炎症性疾病的诊断价值〔J〕.中国误诊学杂志，2010；10(28):6887.

22Starkie R，Ostrowski SR，Jauffred S,etal.Exercise and IL-6 infusion inhibit endotoxin-induced TNF-alpha production in humans〔J〕.FASEB J，2003；17(8)：884-6.

23胡志愿,郭璐娣,邓建欣,等.新生儿呼吸道感染时C反应蛋白和白细胞数量变化分析〔J〕.实验与检验医学,2011；29(1):55.

24赵可伟.运动对白细胞介素-1、白细胞介素-2与白细胞介素-6 影响的研究进展〔J〕.首都体育学院学报，2005；17(5):43-6.

25钟广玲,陈渭良,陈燕平,等.去伤片对创伤瘀血模型大鼠血液流变学的影响及毒理研究〔J〕.广州中医药大学学报,2001；18(2):167-70.

26王 强.简述推拿手法的机理与治疗原则〔J〕.辽宁中医药大学学报,2011；13(1):83-4.