黄芪多糖对人肝癌细胞HepG2凋亡相关基因表达的影响

陈瑾歆 何 军 张娟娟 蒲 宇 王含彦

(川北医学院生物化学教研室,四川 南充 637000)

肝癌发病隐匿，早期无明显症状，发展迅速，预后差，目前尚无的特效治疗方法，常规化疗效果不佳，且西医化疗不良反应大，特别是老年患者难以承受，因此，副作用较小的黄芪多糖(APS)、斑蝥酸钠(SCA)等辅助化疗中药广泛应用于临床，并呈现较好的临床效果。中药抗肿瘤作用的分子机制研究目前较少，本研究通过观察APS联合SCA对HepG2细胞增殖的抑制作用及细胞凋亡相关基因Bcl-2表达的影响，探讨APS诱导HepG2细胞凋亡的分子机制。

1 材料与方法

1.1材料 人肝细胞癌细胞株HepG2(HepG2)，从中国科学院上海细胞所引进；斑蝥酸钠维生素B6注射液(贵州柏强制药有限公司)；APS注射液(天津赛诺制药有限公司)；RPMI1640培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青生物制品有限公司)；一抗：Bcl-2、抗GAPDH抗体(proteintech,USA)；HRP标记羊抗兔二抗(Abcam,USA)。

1.2细胞培养和分组 HepG2细胞以10%胎牛血清的RPMI1640培养基置于37℃、5%的CO2孵育箱中常规培养。实验分为正常对照组(n=5)、SCA处理组(2.5 mg/L，n=5)、APS处理组(200 mg/L，n=5)、APS联合SCA处理组(APS200 mg/L+SCA2.5 mg/L，n=5)。以RPMI1640培养液配制SCA和/或APS注射液。取指数生长期细胞进行实验，血清饥饿法使细胞同步化后弃培养基，分别加入含有SCA和/或APS培养液2 ml，培养24 h备用。

1.3免疫细胞化学染色 用4%多聚甲醛固定各组HepG2细胞，采用细胞免疫组织化学SP法进行免疫组化染色，DAB显色。以胞质呈棕黄色为阳性细胞。

1.4Western印迹 细胞处理24 h后分组收集细胞，用预冷的PBS洗3遍，加入细胞裂解液冰上裂解30 min，离心10 min取上清收集细胞总蛋白，经BCA法分析定量调整蛋白浓度一致，加入5×SDS上样缓冲液，100℃变性5 min。变性的蛋白样品经12%SDS-PAGE电泳分离，电转移至PVDF膜，室温封闭2 h，分别加入一抗：Bcl-2(1∶800)、抗GAPDH抗体(1∶2 000)，4℃孵育过夜，TBST洗膜，加二抗(1∶7 000)室温孵育2 h，再行TBST洗膜，加入ECL发光，常规显影并分析图像，每个样本重复3次。Bcl-2的表达水平以图像Bcl-2与GAPDH的灰度比(Bcl-2/GAPDH)表示，比值越大，Bcl-2的表达水平越高。

2 结 果

2.1APS/SCA对HepG2细胞增殖的影响 见图1，与对照组相比较，各实验组在单位视野中的凋亡细胞均明显增多，其中APS联合SCA处理组的凋亡细胞最多，提示SCA和APS对体外培养的HepG2细胞生长均有抑制作用，APS联合SCA作用最明显。

图1 APS/SCA对HepG2细胞生长的抑制作用(×400)

2.2不同浓度的APS/SCA对HepG2细胞中Bcl-2表达的影响 与对照组相比(0.157±0.011)，SCA处理组和APS处理组Bcl-2表达均受到显著抑制(0.114±0.013、0.122±0.008，P<0.01)；与APS组比较，SCA对HepG2细胞中Bcl-2表达的抑制作用较强，但二者无明显差异(P>0.05)；APS联合SCA处理组Bcl-2表达受到明显抑制(0.079±0.008)，与对照组、SCA处理组、APS处理组比较均有显著差异(P<0.01)。实验结果提示APS联合SCA对HepG2细胞Bcl-2表达的抑制作用更为明显。

3 讨 论

细胞凋亡是在生理或病理条件下由细胞内基因及细胞外因子调控的细胞主动死亡生物学过程〔1〕。目前认为恶性肿瘤发病的主要分子机制是细胞周期紊乱导致肿瘤细胞无限制增生和凋亡减少〔2〕，因此抑制肿瘤细胞恶性增生、诱导肿瘤细胞凋亡目前成为研究肿瘤治疗新途径的热点。细胞凋亡机制复杂，普遍认为线粒体在细胞凋亡过程中发挥着关键性的作用，处于凋亡调控的中心位置，各种凋亡信号刺激细胞损伤引发线粒体内凋亡分子Caspases的级联反应最终导致细胞产生凋亡〔3〕。Caspases凋亡分子的释放受凋亡相关基因的调控，细胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2家族)是研究最早的与凋亡有关的基因，调节上游凋亡信号进入线粒体引发细胞凋亡的线粒体途径〔4〕。Bcl-2家族中Bcl-2为抗凋亡蛋白，其表达减少会导致细胞主动进入凋亡程序〔5〕。

黄芪在抗肿瘤方面展示了较好的效果，APS是黄芪抗肿瘤的有效成分，可调理免疫功能、减轻放化疗毒副反应〔6〕。其抗肿瘤机制尚不明确，传统研究认为APS的抗肿瘤作用可能与增强机体免疫功能的作用有关〔6〕。近年的研究发现其抗肿瘤作用可能还有其他机制如对肿瘤细胞的直接杀伤作用，有一定促进肿瘤细胞凋亡的作用等〔7〕，且APS和其他化疗药物联合应用时具有协同抗肿瘤作用，可明显提高肿瘤治疗的疗效。SCA是一种广谱抗癌药，对消化道恶性肿瘤有较好疗效，有抗癌和免疫调节的双重作用，目前认为作用机制可能是抑制肿瘤细胞的增殖、诱导肿瘤细胞凋亡〔8〕。本研究结果提示：APS和SCA处理HepG2细胞，均可引起细胞凋亡，APS联合SCA处理的细胞凋亡最明显，Western印迹法检测各组凋亡相关基因Bcl-2的表达，APS、SCA处理组Bcl-2基因的表达均明显抑制，但二者间无明显差异，APS联合SCA处理组Bcl-2表达受到的抑制作用最强，实验结果提示APS可能通过对凋亡相关基因Bcl-2表达的调节诱导促进细胞凋亡，与SCA联合应用会增强对肿瘤细胞的抑制作用。综上，APS可明显抑制凋亡相关基因Bcl-2的表达，联合SCA对Bcl-2抑制作用更为明显，其与BAX家族成员协同作用的分子机制还有待于进一步研究。

4 参考文献

1Thompson CB.Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease〔J〕.Science,1995；267:1456-62.

2Roth W.Apoptosis resistance in malignant tumors：novel apoptosis-based therapeutic〔J〕.Pathology，2009；30(2):113-6.

3赵 婧,屈 艺,母得志.Akt与细胞线粒体凋亡途径〔J〕.生命的化学，2010；30(4):528-32.

4李捷萌，陈彦青.线粒体凋亡途径与Bcl-2 家族蛋白研究进展〔J〕.医学综述，2008；14(4)：489-90.

5冯 莉,苏奉发，李 丽,等.H2O2致Hep-G2细胞凋亡及其分子机制初探〔J〕.川北医学院学报，2005；20(1):6-10.

6吕淑华.黄芪多糖抗肿瘤作用研究进展〔J〕.江西中医学院学报，2009；21(1):85-7.

7孙 聪，韩业超,洪 敏，等.黄芪多糖抑制大鼠神经胶质瘤细胞增殖的实验研究〔J〕.中国老年学杂志，2009；29(1)：41-3.

8Kuo JH，Chu YL，Yang JS.Cantharidin induces apoptosis in human bladder cancer TSGH 8301 cells through mitochondria-dependent signal pathways〔J〕.Int J Oncol，2010；37(5):1243-50.