血浆血小板活化因子乙酰水解酶的活性及其与中国人群冠状动脉疾病的关系

施晶晶 朱栋晓 金伟东 王晓彦 庄瑞娟 李拜红 苗宗宁

(无锡市第三人民医院心内科，江苏 无锡 214041)

血浆血小板活化因子(PAF)及其乙酰水解酶(PAF-AH)有可能造成溶血性磷脂酰胆碱(LysoPC)和无氧化脂肪酸的释放，促进动脉粥样硬化〔1〕，导致冠状动脉疾病(CAD)和脑卒中的风险增加〔2〕。欧洲人口的研究一致表明，尽管目前还不清楚血浆PAF-AH与动脉粥样硬化是否有因果关系〔3〕，CAD患者血浆PAF-AH活性升高。血小板活化因子信号通路中的另一个重要的成员是PAF受体，由PTAFR基因编码。 本研究旨在探讨中国CAD人群中血浆PAF-AH活性和PTAFR基因变异情况。

1 对象与方法

1.1研究对象 2000～2010年918例冠心病患者，纳入标准中至少有1个主要的冠状动脉直径狭窄>30%。排除显著的伴随疾病，特别是血流动力学心脏瓣膜病，心肌病和恶性疾病以及发热。术后随访期中位数为3.9(最高5.2)年。因心血管原因死亡组(n=89)，非心血管原因死亡组(n=26)和非致命性心肌梗死(MI)组(n=54)。后续信息死亡和死亡原因的信息由医院或医生获得。

健康对照组485例来源于我院体检科，年龄≥40岁。参与研究对象有中国国籍，并为江苏地区的居民。均由伦理委员会批准。研究对象均签署知情同意书。

1.2实验室方法 晨 8：00经肘静脉抽空腹血5 ml，37℃温育30 min，离心后取血清1 ml，-80℃保存。仪器采用德 国Bayer公司生产的 ACS：180SE型全自动化学发光免疫分析仪，试剂全部由 Bayer公司提供，按说明操作，由该仪器自动给出检测结果。样品一式两份。每次测定前进行质量控制。不抗凝血储存于-80℃。血脂水平测定采用美国贝克曼库尔特AU480全自动生化分析仪检测，包括总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，甘油三酯(TG)。 C-反应蛋白(CRP)测定采用Sysmex XT-2000i全血细胞分析仪。纤维蛋白原采用CA1500全自动血凝仪。白细胞介素-6的酶联免疫吸附法(ELISA)技术检测(ASIATM，Biosource Europe，Fleurus，Belgium)。

1.3筛选基因多态性PTAFR基因 采用聚合酶链式反应-单链构象多态(PCR/SSCP)技术进行等位基因特异性寡核苷酸基因多态性鉴定。利用Primer Express版本2.0设计PCR引物和TaqMan MGB探针。在GeneAmp9700热循环仪96孔板进行反应。荧光测定使用ABI PRISM7000序列检测系统和ABI PRISM7000 SDS1.0版软件分析。

1.4统计学方法 估计等位基因频率用基因计数，进行对数线性分析。偏离Hardy-Weinberg平衡采用χ2检验。PAF-AH活性数转换，除去阳性的偏度，报道几何平均数(95%CI)。 Cox回归分析检测多态性与预期结果的联系。研究终点是心血管原因和非致命性MI死亡。分析PTAFR基因单体型与不同表型(病例对照的状态，PAF-AH活性和生存结果)的联系。二进制和连续表型的单体型分析，利用先前所描述的模型实施的SEM算法和Cox制定。单倍型的影响(95%CI)表示为一个二进制性状平均值，效果持续特性和(HRRs)为生存的结果。参考单体型被选为最常见的一种。单体型和表型之间的联系采用似然比检验。除单体型分析，以上采用SAS8.01软件。生化指标比较采用ANOVA方法进行分析。采用Mann-WhitneyU分析变量的正态分布情况。心血管疾病危险因素与PAF-AH活性性别调整的关联分析，采用ANOVA分析和Pearson相关系数进行了分析。 PAF-AH相关的CAD比值比(ORS)被调整为相同的变量进行Logistic回归分析。以上采用SPSS10.07软件。

2 结 果

2.1病例组和对照组的一般情况 与对照组相比，男女冠心病患者更经常地吸烟，有糖尿病和高血压的发病率较高，并有一个更加不利的血脂水平。可能是由于为他们服用他汀类药物，并导致TC和LDL-C水平低于对照组的水平。男女患者的炎症标志物显著增加。与对照组相比，女性病例PAF-AH活性显著增加，男性病例无明显差异。见表1。

表1 病例组和对照组的一般情况

2.2性别校正后PAH-AH的平均活性比较 对照组女性比男性具有明显的PAF-AH低活性。糖尿病或者吸烟不会影响两组的PAF-AH活性。病例组高血压者的PAF-AH活性比非高血压者明显降低。对照组并不显示高血压的差异。尽管血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)显著降低CAD患者PAF-AH的活性，但是这一效果在高血压低PAF-AH患者并不明显。其他药物包括倍他乐克或者钙拮抗剂不影响PAF-AH的活性。接受他汀类药物的患者也显示较低的PAF-AH活性，而这个效果在对照组是相反的。急性冠状动脉综合症(ACS)患者有较高PAF-AH活性(P<0.000 1)。见表2。

表2 两组性别校正后PAH-AH的平均活性比较

2.3性别校正后PAF-AH，血脂变量，炎症标志之间的pearson相关分析 见表3。PAF-AH在所有分组与LDL和TC以及apoB-100活性有很强的相关性。PAF-AH与与HDL和apoA-I浓度控制和ACS患者呈现负相关。除在ACS患者组之外，PAF-AH与炎性介质无相关性。

表3 性别校正后PAF-AH、血脂变量、炎症标志之间的Pearson相关分析(r值)

2.4根据临床状况按性别分层的PAF-AH活性 见表4。PAF-AH的活性与CAD呈现相关性(P<0.05)。男女ACS患者出现PAF的活性水平升高。控制传统的风险因素后，差异仍然显著。不接受他汀类药物或ACEI治疗时相关性加强。对照组，病例组PAF-AH的活性逐渐增多而不论性别。

2.5PTAFR基因的筛选 图1可见，筛选出完整的外显子序列(1 931 bp)，以及两个位于第1外显子和第2外显子(共3 326 bp)上游区域和位于第3外显子(249 bp)的下游区域。2个C/T分别替换5′端第2个外显子-838和-414位置。没有发现C-414T多态性。一个A/T替换从-1209开始的5′端外显子1。一个A/G的替代被发现于终止密码子(+503G)+503的位置。对照组PTAFR基因的等位基因频率和配对连锁不平衡见表5，基因型的分布没有显著偏离Hardy-Weinberg平衡。

表4 根据临床状况按性别分层的PAF-AH活性

图1 筛选确定的PTAFR基因多态性

表5对照组PTAFR基因的等位基因频率和配对连锁不平衡(n=485)

多态性等位基因频率PTAFR/A+503G(+/-D)PTAFR/C-838/ex2ntT0.95/0.05-0.79PTAFR/A+503G0.78/0.14-

2.6PTAFR 基因多态性在 CAD患者和对照组的基因型分布 见表6。男性和女性之间的异质性差异不显著。两个PTFAR基因多态性基因型分布在两组间没有显著差异。

表6 两组PTAFR基因多态性基因型分布〔n(%)〕

2.7PTAFR基因多态性与随访期间心血管事件 见表7。PTAFR的 T-838A+503的C-838A+503与随访期间的心血管事件有较显著的关联(HRR=1.50，95%CI：0.98～2.30，P=0.061)。

表7 随访期间冠心病患者心血管事件发生率〔n(%)〕

3 讨 论

血浆PAF-AH浓度于CAD时显著增加。PAF-AH在高胆固醇血症的中年男性人口与CAD的风险表现出强烈的正相关。PAF-AH是磷脂酶A2(PLA-2)家族中独特的一组，具有明显的底物选择性〔4，5〕，可作用于PAF以及结构和生物学活性类似于PAF的氧化磷脂，这些底物的共同结构是在sn-2位置上具有酰基，而且在某些疾病中常有一定相关性。目前发现PAF-AH有分泌型(血浆型)和细胞内型等多种同工酶〔6，7〕。决定CAD临床表现的因素，不单是动脉粥样硬化斑块的数量、分布和狭窄的严重程度，更为重要的是外在触发因素与斑块内在特性相互作用，导致斑块病变基础上血栓形成的斑块损伤包括斑块的浅表溃疡和斑块破裂。斑块溃疡暴露出内皮下的胶原纤维和血管性血友病因子(vWF)，血浆PAF-AH浓度升高。诱发血小板黏附和聚集。

大多数炎症性疾病PAF-AH轻度升高，另外，妊娠、高血压、血管性疾病、缺血性脑卒中、尿毒症、艾滋病等可出现升高现象，升高的PAF-AH可减轻PAF和氧化磷脂的炎症介质效应。炎症反应标记物CAD往往伴有炎症过程并释放急性相蛋白，如CRP，淀粉蛋白A，总硅酸等。CRP可反映动脉硬化过程中，尤其是血栓闭塞并发症中存在低度的炎症过程。

接受他汀类药物的患者也显示较低的PAF-AH活性这一结论与Tsimihodimos等〔8〕的研究结果一致。

本研究结果显示，PAF-AH被认为是诱发炎症反应。因此，PAF-AH是否是CAD的风险指标，或直接促进动脉粥样硬化。轻度炎症和氧化压力下，PAF-AH将作为对抗脂质过氧化保护酶，严重的压力下，转换成不利因素，例如，释放过量脂肪酸的氧化产物，增强炎症反应。另外，PAF-AH可能始终是一个保护因素，如果不上调，在疾病状态，情况会更糟。事实上，在日本的研究发现，PAF-AH基因缺失突变Val279Phe由于已被证明是一个CAD和脑卒中的独立危险因素〔9〕。研究人员发现〔10〕，PAF-AH活性增加男性和女性的年龄适应性机制，以防止年龄依赖性的血管壁损伤。

4 参考文献

1Yamada Y，Yoshida H,Ichihara S,etal.Correlations between plasma platelet-activating factor acetylhydrolase (PAF-AH) activity and PAF-AH genotype，age and atherosclerosis in a Japanese population〔J〕.Atherosclerosis,2000；150：209-16.

2Hiramoto M,Yoshida H,Imaizumi T,etal.A mutation in plasma platelet-activating factor acetylhydrolase (Val279→Phe) is a genetic risk factor for stroke〔J〕.Stroke,1997；28：2417-20.

3Blankenberg S,Stengel D，Rupprecht H,etal.Plasma PAF-acetylhydrolase in patients with coronary artery disease.Results of a cross-sectional analysis〔J〕.J Lipid Res,2003；44：1381-6.

4Crte-Real R，Gomes RN，Castro-Faria-Neto HC，etal.The activity of platelet activating factor-acetyl hydrolase (PAF-AH) in the salivary glands of Rhodnius prolixus〔J〕.J Insect Physiol,2011；57(6):825-9.

5Wegner M，Araszkiewicz A，Pioruńska-Mikoajczak A,etal.The evaluation of IL-12 concentration，PAF-AH，and PLA(2) activity in patients with type 1 diabetes treated with intensive insulin therapy〔J〕.Clin Biochem,2009；42(16-17):1621-7.

6Mitsutake R，Miura S，Zhang B,etal.HDL-associated factors provide additional prognostic information for coronary artery disease as determined by multi-detector row computed tomography〔J〕.Int J Cardiol,2010；143(1):72-8.

7Balta G,Gurgey A,Kudayarov DK，etal.Evidence for the existence of the PAF-acetylhydrolase mutation (Val279Phe) in non-Japanese populations：a preliminary study in Turkey，Azerbaijan，and Kyrgyzstan〔J〕.Thromb Res,2001；101：231-4.

8Tsimihodimos V，Gazi I，Filippatos T,etal.Plasma triglyceride levels and body mass index values are the most important determinants of prebeta-1 HDL concentrations in patients with various types of primary dyslipidemia〔J〕.Atherosclerosis,2010；208(2):506-11.

9Shimokata K，Yamada Y，Kondo T,etal.Association of gene polymorphisms with coronary artery disease in individuals with or without nonfamilial hypercholesterolemia〔J〕.Atherosclerosis，2004;172(1):167-73.

10Nordin N，Jalil J，Jantan I,etal.Platelet-activating factor (PAF) receptor binding activity of the roots of Enicosanthellum pulchrum〔J〕.Pharm Biol,2012；50(3):284-90.