电针穴位刺激治疗对大鼠脊髓急性损伤运动功能及神经生长因子表达的影响

2014-09-12路银芝

中国老年学杂志 2014年16期

路银芝

(河南经贸职业学院，河南郑州 450000)

受急性运动或外界暴力因素造成的脊髓损伤(SCI)是一种常见病，且致残率高〔1〕。相关研究提示，哺乳动物脊髓损伤所致肢体瘫痪或运动功能障碍的主要病因与脊神经损伤有关，而脊神经损伤后，通过内源性修复产生的新生神经细胞极少，也难以启动功能性轴突再生〔2〕，故后期康复较难。电针疗法是将电流刺激和针刺结合起来治疗疾病的方法，例如杨拯等〔3〕研究指出，督脉电针能够治疗脊髓损伤，促进肢体功能康复；也另有相关成果从理论分析和实践研究的角度对其进行了阐述，多数认为促进肢体功能康复的主要原因应与脊神经的再生和重建有关。本研究通过建立脊神经急性损伤大鼠模型，对其进行电针穴位刺激治疗，观察大鼠肢体运动功能恢复和神经生长因子(NGF)表达的效果。

1 资料与方法

1.1实验材料 Wistar健康大鼠(购自郑州大学医学院动物饲养中心)，雄性，清洁级，8～10周龄，体重(162±12) g；脊髓损伤大鼠建模成功后，将实验组和对照组大鼠分笼饲养(动物房合格证号：豫医动字第4104022号)，室温控制在24℃左右，室内通风良好，由专人统一饲养和料理；每天腹腔注射青霉素8×104U，连续3 d，同时每日两次对大鼠进行清理和消毒，避免伤口感染；每天挤压膀胱辅助排尿3次，至膀胱功能恢复为止；每8 h对大鼠喂食一次，食量以大鼠自由进食为主配以针管经口腔注喂流体食物为辅，两组大鼠于护理期间无死亡。SDZ-IV型电针治疗仪(苏州医疗用品厂有限公司)；NGF与脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)抗体(购自Santa Cruz公司)；注射用青霉素钠(石药集团中诺药业有限公司产品，批号：09119209)以及生理盐水等相关常用药械。

1.2脊髓损伤模型的建立取实验对象Wistar大鼠45只备用，雄性，清洁级，标记每只大鼠的周龄和体重。用特制椎板钳咬除实验动物T8及T9棘突及椎板，显露硬膜。使用动脉瘤夹子，直接钳夹T9段脊髓约0.5 s，操作方法：用改良的动脉瘤夹子尽量咬除T9段棘突及椎板，标定力量为35 g，用持夹器将动脉瘤夹打开，然后突然释放动脉瘤夹，使脊髓受到突然的暴力打击，打击用时约0.5 s，操作过程中确保动脉瘤夹的位置准确。相关研究〔4〕指出：该法能保持硬脊膜的完整性，且脊髓损伤后的解剖结构与神经功能的变化与挫伤型脊髓损伤非常相似，且力量从2～98 g过程中发现钳夹力越大，损伤区域残存的轴突越少，功能恢复越不理想。故，本研究标定力量为35 g。以快速挤压造成脊髓急性完全损伤，建立脊神经急性损伤模型。以鼠尾痉挛性摆动、双下肢瘫为损伤标准。选取造模成功进入实验动物30只，随机分成实验组和对照组，每组15只，2组大鼠体重、周龄、下肢瘫痪程度等基本指标无显著性差异(P>0.05)，具有可比性。

1.3治疗方法实验组：固定状态下电针穴位刺激，于建模后第4天开始治疗。治疗过程：取大鼠俯卧位，将头部和四肢捆绑固定，选损伤段上下2个椎体的“夹脊穴”作为电针穴位，将治疗仪上的两根长25 mm直径0.2 mm的针灸针刺入所选穴位，正极接近头端，负极接近尾端，采用疏密波，频率为10/50 Hz，电流强度以大鼠后肢出现颤动为度，留针治疗25 min/次，每日1次。对照组：固定状态下假电针穴位刺激，假电针取穴同电针治疗组，进针后不予电刺激，其他治疗过程、治疗方法及治疗时长等，均同实验组。2组大鼠均于建模后第4天开始治疗，每天治疗1次，每次治疗25 min，共计治疗60 d。

1.4疗效评价 ①后肢运动功能评估：采用BBB运动功能评分系统对两组大鼠后肢运动功能进行评估。分别在第1次电针治疗后的第10、20、30、40、50、60天，由同一实验人员，参照BBB评分法细则，连续对实验大鼠后肢运动功能进行单盲法评分。BBB评分标准将大鼠后肢运动分为22个等级，后肢全瘫为0分，完全正常为21分，具体方法和内容详见文献〔5〕。

②NGF和BDNF检测：第61天采用断头法统一处死2组大鼠，开胸，经心灌注200 ml 4℃的生理盐水冲去血管中的血液，然后灌注4%的4℃的多聚甲醛磷酸盐缓冲液(pH7.2～7.4)500 ml。灌注固定30 min后，取损伤区T8及T9段脊髓放入4%的多聚甲醛磷酸盐缓冲液24 h以上，于切片前先天晚上在最接近横断处切下1 cm放入20%蔗糖溶液中4℃过夜，石蜡包埋，用恒冷切片机连续切片，片厚25 μm。疫组织化学染色严格按照试剂盒操作说明进行，以PBS代替一抗作阴性对照。每只大鼠随机取5张切片，运用图像分析卡(北京天地公司产)，IBM586和Olympus Bx60显微镜组成的图像处理系统观测，计算阳性反应胞体的数量。分别计算各组NGF、BDNF阳性细胞的平均值。

2 结果

2.1BBB评分比较建模前所选备用大鼠BBB评分均为21分。建模后至第3天(电针治疗前一天)两组大鼠均表现为完全截瘫，BBB评分为0分。电针治疗第10天至第20天，对两组大鼠后腿进行针刺，有回缩反应，但组间差异不明显。经在第30天及在之后的天次检测过程中，发现治疗组后肢运动功能日趋明显,且显著优于对照组，电针治疗第30、40、50、60天，两组评分差异有统计学意义(均P<0.05，P<0.01)。见表1。

2.2NGF和BDNF检测比较发现经60 d电针穴位刺激治疗，治疗组NGF和BDNF蛋白表达量显著高于对照组(均P<0.01)。见表2。

表1 电针治疗期间两组大鼠后肢活动功能BBB评分比较(n=15,±s)

表2 两组大鼠NGF和BDNF免疫组化阳性表达比较(个，n=15,±s)

3 讨论

SCI造成的肢体瘫痪或下肢功能障碍，是临床医学面临的一个世界性难题。多数研究认为，神经系统受损造成大量神经元缺失后，因不能产生新的神经元建立新的突触联系，是致使患者难于康复的主要病因〔6〕。可见，如何促进神经元再生并建立新的突触联系应成为临床治疗的关键。电针疗法是在传统中医的基础上发展起来的一种现代物理疗法，具有电流刺激和针刺双重治疗的作用。相关研究提示，电针治疗不但可以改善血液循环促进患体代谢和修复，而且利于抵抗自由基，减少继发性损害，并且具有降低Ca2+含量，保护损伤神经、抑制细胞凋亡和恢复神经元兴奋性的作用〔7,8〕。例如，刘丽霞〔9〕、陈虹等〔10〕研究证实，电针刺激治疗可以促进受损神经元的轴突再生；郭召〔11〕、邓娜等〔12〕也研究表名，电针治疗不但具有维护神经元的自我保护机制，也可激发神经元的发育和生长，进而利于患体建立新的突触联系及肢体功能恢复。

本研究对脊髓急性损伤大鼠进行了电针穴位刺激治疗，通过观察NGF和BDNF蛋白量的表达情况及肢体运动功能康复的效果，以探讨电针刺激的疗效和相关治疗机制。经在第30天及在之后的第40、50、60天检测中，发现治疗组(电针组)后肢运动功能日趋明显优于对照组(假电针组)，t值依次为3.175、6.976、5.163和6.425，均P<0.05或P<0.01，评分差异有统计学意义。60 d治疗后，经对两组大鼠NGF与BDNF蛋白量表达情况检测，发现治疗组NGF和BDNF蛋白量表达情况高于对照组，均P<0.01，差异具有显著性。NGF是一类已被证实的能够促进和维持神经生长、生存、分化和执行功能的特种蛋白，还可挽救损伤的神经元〔13〕；BDNF是神经营养因子家族中重要成员，它与NGF有50%同源性〔14〕，不仅在中枢神经系统发育过程中对维持神经元正常的生理功能等方面起重要作用，还可诱导神经突起定向生长等。可见，NGF和BDNF是干预神经修复机制的重要物质，对神经成长与修复的效果有着重要的影响，也就是说NGF和BDNF物质表达的效果将直接影响着神经修复的效果。故SCI的大鼠电针刺激治疗后，显著提高NGF和BDNF蛋白的表达有助于促进神经元的再生并建立新的突触联系，进而利用下肢运动功能的恢复。所以，研究提示，电针穴位刺激利于SCI大鼠NGF和BDNF蛋白的表达及下肢运动功能的恢复，而肢体功能恢复应与NGF和BDNF的表达促进神经元再生并建立新的突触联系有关，且电针疗法是简便易行，无副作用、安全可靠，值得临床实践治疗和进一步深入研究。

4 参考文献

1陈启波.针灸结合康复治疗干预时机对不同程度脊髓损伤患者神经功能恢复的影响〔J〕.中国老年学杂志,2011;31(5):772-3.

2张延洁,蔡芳,杨一峰.中老年人骨髓间质干细胞的生物学特性研究〔J〕.中国生物工程杂志,2005;25(4)：33．

3杨拯,何彦芳,陈建敏,等.电针在脊髓损伤功能康复中的研究〔J〕.时珍国医国药,2011;22(1):249-50.

4祖波,尹宗生.机械性脊髓损伤模型的建立及其评价〔J〕.中国临床康复,2006;10(12):151-3.

5顾摇兵,金建波,李华南,等.脊髓损伤动物模型的运动功能评价〔J〕.中国药理学通报,2011;21(7):893-7.

6陈蓉.电针联合药物治疗结核性脑膜炎临床疗效比较〔J〕.现代预防医学,2012;39(15):4004-5.

7韦登明,贾学敏,尹向旭,等.电针改善血管性痴呆大鼠学习记忆及其与海马神经细胞蛋白激酶C表达的关系〔J〕.中国老年学杂志,2013;33(2):328-30.

8胡啸玲,周忠群,周志刚,等.电针麻醉方法对大白鼠外伤疼痛IL-2、sIL-2R、IFN-γ的影响〔J〕.现代预防医学,2011;38(10):1922-3.

9刘丽霞,邰浩清.电针对脊髓损伤作用机制的研究〔J〕.长春中医药大学学报,2011;27(3):405-6.

10陈虹,李俊岑,党彦丽,等.电刺激对大鼠脊髓损伤后神经生长因子表达的影响〔J〕.中国康复理论与实践,2012;18(1):33-6.

11郭召,丁文元.脊髓损伤治疗的最新研究进展〔J〕.颈腰痛杂志,2010;31(2):139-42.