Twist基因沉默促进人胃癌SGC7901细胞凋亡的机制

刘洪义 于金海 王大广 所 剑

(天津市南开医院，天津 300100)

Twist异常高表达可能引起肿瘤，研究发现黑色素瘤、横纹肌肉瘤、前列腺癌等恶性肿瘤中Twist呈高表达〔1～3〕。多数学者认为Twist是癌基因，能调节肿瘤细胞的凋亡、侵袭和转移，在肿瘤的发生发展过程中发挥重要的作用〔4〕。本课题组研究发现，Twist在正常胃组织中低表达，而在胃癌组织中高表达，表明Twist可能参与胃癌的发生发展过程。通过对稳定转染pGenesil-Twist质粒的人胃癌SGC7901细胞的生长活力的研究发现，Twist基因沉默可抑制SGC7901细胞的增殖〔5〕，探讨细胞生长抑制的机制时发现，Twist基因沉默可促进SGC7901细胞凋亡〔6〕。本研究将进一步探讨Twist基因沉默促进SGC7901细胞凋亡的机制。

1 材料与方法

1.1材料 人SGC7901细胞株由吉林大学中日联谊医院中心实验室惠赠；稳定转染pGenesil-Twist质粒的SGC7901细胞株由本实验室建立；RPMI1640和H-DMEM培养液购于Invitrogen公司；小牛血清购自杭州四季青公司；AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自南京凯基；p53单克隆抗体、Bax-FITC单克隆抗体、Bcl-2-FITC单克隆抗体、羊抗鼠IgG-FITC购自Santa Cruz公司；Caspase3、9检测试剂盒和Fluo3AM试剂盒购自碧云天生物试剂公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 人SGC7901细胞株和稳定转染pGenesil-Twist质粒SGC7901细胞株培养于含10%小牛血清RPMI1640的培养液中，在5%CO2，37℃细胞培养箱中恒温培养。

1.2.2细胞分组 根据转染的质粒不同分为对照组，空载体组，Twist基因沉默组。

1.2.3AnnexinV-FITC/PI染色观察沉默Twist基因对细胞的影响 每组细胞培养至90%融合，收集1×106细胞于离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清，用1 ml细胞染色缓冲液重悬细胞，各组分别加入5 μl AnnexinV-FITC染液和10 μl PI染液，轻轻混匀，4℃避光30 min后将细胞滴在载玻片上，共聚焦显微镜下观察，剩余细胞悬液流式细胞仪检测。

1.2.4Twist基因沉默后对SGC7901细胞p53、Bcl-2 和Bax蛋白表达的影响 p53蛋白的检测：每组细胞培养至90%融合，胰酶消化，离心收集1×106个细胞，75%冷乙醇固定，磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，正常山羊血清50 μl 4℃封闭30 min，阻止非特异结合，各组加入鼠源p53单克隆抗体1 μl，4℃避光反应45 min，PBS洗2次，各组加入羊抗鼠IgG-FITC 1 μl，总体系50 μl，4℃反应45 min，PBS洗2次，用300 μl PBS重悬细胞后，流式细胞仪检测。

Bcl-2和Bax蛋白的检测：每组细胞培养至90%融合，胰酶消化，离心收集1×106个细胞，75%冷乙醇固定，PBS洗2次，分组加入Bcl-2-FITC抗体20 μl，Bax-FITC抗体10 μl，总体系50 μl，4℃避光反应45 min，PBS洗2次，用300 μl PBS重悬细胞后，流式细胞仪检测。

1.2.5Twist 基因沉默后对SGC7901细胞Caspase3、9 活性检测 实验方法参照试剂盒说明书。

1.2.6Twist基因沉默对SGCC7901细胞Ca2+含量的影响 每组细胞培养至90%融合，胰酶消化，离心收集1×106个细胞，PBS洗3次，加入终浓度为10 μmol/L的Fluo-3 AM于37℃，5%CO2孵箱内负载50 min，PBS洗3次，再次孵育30 min后于流式细胞仪在激发波长488 nm，发射波长530 nm 条件下检测荧光强度。

2 结 果

2.1AnnexinV/PI染色观察Twist基因沉默对SGC7901细胞的影响 激光共聚焦显微镜检测结果显示，与对照组和空载组相比，Twist基因沉默组中有较多的细胞呈现绿色荧光，未见明显的呈现红色荧光的细胞。进一步采用流式细胞仪检测，Twist基因沉默组AnnexinV-FITC阳性细胞的比例〔(37.74±2.997)%〕明显高于SGC7901组〔(14.92±2.163)%〕和空载体组〔(15.32±1.901)%〕(P<0.01)。见图1。

对照组 空载体组 Twist基因沉默组

2.2Twist基因沉默后对SGC7901细胞p53、Bcl-2和Bax蛋白表达的影响 Twist基因沉默组p53蛋白表达量(69.21±3.275)显著高于对照组(33.36±28.67)和空载体组(28.57±2.342)(P<0.01)，Bcl-2蛋白表达量(19.56±1.154)显著低于对照组(75.35±2.132)和空载体组(108.51±3.294)(P<0.01)，Bax蛋白表达比例(52.63±2.695)显著高于对照组(26.13±1.267)和空载体组(46.37±2.953)(P<0.01)。

2.3Twist 基因沉默对SGC7901细胞Caspase3、9活性及Ca2+含量的影响 Twist 基因沉默组Caspase3、9活性明显高于对照组和空载体组(P<0.01，P<0.05)。Ca2+含量显著高于对照组和空载体组(P<0.05)。见表1。

表1 Twist基因沉默对SGC7901细胞Caspase3、9活性及Ca2+含量的影响±s)

3 讨 论

细胞凋亡是机体细胞在正常生理或病理状态下发生的一种自发的程序性死亡过程。Twist蛋白在细胞程序性死亡过程中发挥了调控作用。SCS中的Twist-1单倍剂量不足能够诱导颅盖成骨细胞凋亡，哺乳动物Twist-1纯合性失活模型出现大量凋亡〔7〕。Twist-2对细胞因子诱导的凋亡极其敏感〔8〕。小鼠胚胎成纤维细胞体外实验进一步表明，Twist-1能够干ARFp53调节途径，阻断c-myc诱导的凋亡反应〔9〕，而且在鼠间充质细胞C3H10T1/2中DNazyme介导的小鼠Twist-1转录因子断裂促进了细胞凋亡〔10〕。Rosivatz等〔11〕在研究原发性胃癌上皮间质转变过程中发现Twist在此过程中发挥重要作用。提示Twist的表达影响胃癌细胞的侵袭与转移。Stasinopoulos等〔12〕的研究结果表明，Twist能通过抑制细胞分化、干预p53肿瘤抑制基因通路、诱导上皮-间质转变等在肿瘤的侵袭和进展中发挥重要作用。本研究前期工作证实Twist基因沉默促进SGC7901细胞凋亡〔6〕，本研究证实Twist基因沉默促进细胞早期凋亡的发生。目前研究表明Twist是一种癌相关蛋白，能通过抑制ARF-p53依赖和非依赖途径调节凋亡，可能作用于p53调节的不同步骤，包括转录控制和翻译后修饰〔13〕。本研究证实Twist基因沉默可促进细胞p53蛋白的表达。p53通过Bax/Bcl2，Fas/Apo1，IGF-BP3等蛋白，可完成对细胞凋亡的调控作用。p53可以上调Bax的表达水平，以及下调Bcl-2的表达共同完成促进细胞凋亡作用〔14〕。Twist基因沉默后SGC7901细胞发生凋亡与线粒体跨膜电位关系密切〔6〕。提示Twist沉默的SGC7901细胞发生凋亡有可能主要受线粒体介导的细胞凋亡途径调控。Bcl-2蛋白主要是通过对抗线粒体破裂的离子失衡，从而阻断细胞色素C释放，或直接抑制Caspase活化从而抑制细胞凋亡反应的。此外，促凋亡蛋白Bax可使线粒体膜通透性增强激活Caspase-3和Caspase9，最终实现线粒体介导的细胞凋亡途径。研究表明，胃癌的发生可能源于前凋亡蛋白Bax的失活。本研究显示沉默Twist基因后可显著升高细胞中Bax的表达，同时降低Bcl-2的表达。提示Bcl-2家族蛋白在Twist基因沉默后诱导的胃癌细胞凋亡的途径中发挥了关键作用；同时Twist沉默组细胞中Caspase3、9活性明显高于对照组，提示Twist沉默后可通过调节Bcl-2和Bax蛋白表达，激活Caspase3、9，实现线粒体介导的细胞凋亡途径。另一方面，在透射电镜下还发现沉默组细胞的内质网显著扩张〔6〕。内质网是细胞内蛋白质合成、翻译后修饰、折叠和维持细胞内钙稳态的主要场所，同时也是钙储备和钙信号转导的主要部位。本研究提示沉默 Twist基因后可能使细胞内质网扩张、细胞内钙储存量增加。内质网中Ca2+稳态的的失衡可以直接导致细胞发生凋亡。Ashkenazy-Shahar〔15〕等研究发现通过抑制钙外流和Ca2+直接进入细胞均能使细胞发生凋亡、损伤或坏死。

4 参考文献

1Jinushi M，Nakazaki Y，Carrasco DR，etal.Milk fat globule EGF-8 pro-motes melanoma progression through coordinated Akt and twist signaling in the tumor microenvironment〔J〕.Cancer Res，2008；68(21)：8889-98.

2Hao L，Ha JR，Kuzel P，etal.Cadherin switch from E-to N-cadherin in melanoma progression is regulated by the PI3K/PTEN pathway through Twist and Snai〔J〕.Br J Dermatol，2012；166(6)：1184-97.

3Ohuchida K，Mizumoto K，Ohhashi S，etal.Twist，novel oncogene，is up-regulated in pancreatic cancer：clinical implication of Twist expression in pancreatic juice〔J〕.Int J Cancer，2007；120(8)：1634-40.

4Zhu Q，Xu H，Xu Q，etal.Expression of Twist gene in human hepatocellu-lar carcinoma cell strains of different metastatic potential〔J〕.J Huazhong Univ Sci Tech Med Sci，2008；28(2)：144-6.

5刘洪义，孙 梅，所 剑.RNA 干扰沉默 Twist 基因对人胃癌细胞系 SGC7901 细胞增殖能力的影响〔J〕.中国老年学杂志，2009；29(7)：826-8.

6刘洪义，邢 金，所 剑.Twist 基因沉默对人胃癌SGC7901细胞凋亡的影响〔J〕.中国老年学杂志，2012；32(16)：3464-6.

7Chen ZF，Behringer RR.Twist is required in head mesenchyme for cranial neural tube morphogenesis〔J〕.Genes Dev，1995；9(6)：686-99.

8Sosic D，Richardson JA，Yu K,etal.Twist regulates cytokine gene expression through a negative feedback loop that represses NF-κB activity〔J〕.Cell，2003，112(2)：169-80.

9Maestro R，Dei Tos AP，Hamamori Y,etal.Twist is a potential oncogene that inhibits apoptosis〔J〕.Genes Dev，1999；13(17)：2207-17.

10Hjiantoniou E，Iseki S，Uney JB,etal.D Nazyme-mediated cleavage of Twist transcripts and increase in cellular apoptosis〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2003；300(1)：178-81.

11Rosivatz E，Becker I，Specht K,etal.Differential expression of the epithelial-mesenchymal transition regulators snail，SIP1，and twist in gastric cancer〔J〕.Am J Pathol，2002；161(5)：1881-91.

12Stasinopoulos IA，Mironchik Y，Raman A,etal.HOXA5-twist interaction alters p53 homeostasis in breast cancer cells〔J〕.J Biol Chem，2005；280(3)：2294-9.

13Puisieux A，Valsesia-Wittmann S，Ansieau S,etal.A twist for survival and cancer progression〔J〕.Br J Cancer，2006；94(1)：13-7.

14Patry C，Bouchard L，Labrecgue P,etal.Small interfering RNA-mediated reduction in heterogeneous nuclear ribonucleoparticule A1/A2 proteins induces apoptosis in human cancer cells but not in normal mortal cell lines〔J〕.Cancer Res，2003；63(22)：7679-88.

15Ashkenazy-Shahar M，Beitner R.Effects of Ca(2+)-ionophore A23187 and calmodulin antagonists on regulatory mechanisms of glycolysis and cell viability of NIH-3T3 fibroblasts〔J〕.Mol Genet Metab，1999；67(4)：334-42.