养血清脑颗粒改善血管性痴呆大鼠海马神经元氧化损伤的机制

王宏英 刘 磊 谭 岩 方艳秋

(长春中医药大学基础医学院生物化学教研室，吉林 长春 130117)

血管性痴呆(VD)是危害老年人身心健康的常见病、多发病〔1〕。VD多源于缺血性脑病，出血性脑病及急慢性缺血缺氧性脑病所致的智能及认知功能障碍临床综合征，主要的病理学改变包括皮质萎缩、皮质和海马神经元变性、白质疏松、胶质细胞增生和毛细血管床改变等。氧化应激损伤是加重缺血后脑损伤的重要机制之一〔2〕。本研究拟明确脑缺血后海马自由基的变化规律和对神经元细胞凋亡的作用，探索养血清脑颗粒对脑组织自由基的清除作用和对大鼠认知功能维持的影响。

1 材料与方法

1.1VD大鼠模型制备 健康雌性Wistar大鼠36只，鼠龄4～7个月，体重280～350 g，吉林大学实验动物中心提供和喂养。随机分为假手术组(正常对照组)、模型对照组、养血清脑颗粒组。大鼠用10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔注射麻醉，颈部正中切口，分离双侧颈总动脉，分别结扎双侧颈总动脉的远近端，并从中间剪断，以确保阻断颈总动脉血流。假手术组除不结扎、不剪断双侧颈总动脉外，其余过程与手术组相同。养血清脑颗粒组术前10 d及术后每天用养血清脑颗粒灌胃，共灌胃45 d。假手术对照, 模型对照组大鼠给予生理盐水3 ml/d,1次/d灌胃。

1.2实验试剂及仪器 养血清脑颗粒浸膏(简称养血清脑颗粒，批准文号：国药准字Z10960082)，由天士力制药集团提供，每克浸膏含生药7 g，以蒸馏水将浸膏稀释4.8 g/ml，每只大鼠给药容积为10 ml/kg。超氧化物歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)和乙酰胆碱酯酶(AchE)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。细胞凋亡检测试剂盒购自贝克曼库尔特商贸有限公司。

1.3记忆功能的测定 于造模后第15天采用Morris水迷宫法进行大鼠记忆功能的测定。实验训练阶段连续进行4 d，每天训练2次，进行Morris水迷宫的定位航行实验训练。之后连续4 d进行定位巡航实验，每日2次,计算平均成绩。

1.4海马组织SOD、MDA、AchE的检测〔3〕海马组织称重后，加入9倍冰生理盐水，电动匀浆机中研磨成10%匀浆，3 500 r/min，离心10 min。取上清液，G250法测定总蛋白含量，以供生化指标检测。用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性，用硫代巴比妥酸(TBA)法测定MDA水平。AchE能使乙酰胆碱(Ach)水解成胆碱和乙酸,胆碱可以与巯基显色剂反应生成黄色化合物对硝基三苯(TNB)，根据颜色深浅进行比色定量，水解产物胆碱的数量可反映AchE的活力。

1.5海马神经元细胞凋亡率的测定〔4〕取脑组织0.5～1 g，放入清洁干燥的烧杯内，加适量PBS液，用锐利眼科剪刀将组织剪碎，300目尼龙网过滤至离心管内，1 500 r/min，5 min，弃上清后加入PBS液5 ml混匀离心洗涤2次，弃上清调整细胞数为1×106/ml。乙醇固定于4℃冰箱保存。检测前PBS液洗涤2次去上清液，加入PI染液500 μl/管, 避光静置30 min后用流式细胞仪进行细胞倍体及周期检测。

2 结 果

2.1大鼠认知功能比较 模型对照组大鼠逃避潜伏期及逃避路径长度较假手术组大鼠明显延长(P<0.05)，而养血清脑颗粒组大鼠逃避潜伏期及逃避路径长度比模型对照组大鼠明显缩短(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠逃避潜伏期逃避路径比较(n=6,±s)

2.2海马组织SOD、MDA、AchE水平比较 与假手术组比较，模型对照组大鼠脑组织SOD水平显著降低，MDA水平显著增高(P<0.05)。养血清脑颗粒组大鼠海马SOD水平增高，并降低了MDA的表达，与模型对照组相比差异显著(P<0.05)。与假手术组相比，模型对照组大鼠海马中AchE活性明显上升(P<0.05)；与模型对照组相比，养血清脑颗粒组能明显降低大鼠海马组织中AchE活性(P<0.05)。见表2。

表2 不同组大鼠脑组织内SOD活性、MDA含量、AchE活性测试结果±s,n=6)

2.3流式细胞仪测定凋亡细胞百分率 与假手术组〔(6.45±2.42)%〕比较，模型对照组细胞凋亡百分率〔(19.21±4.52)%〕明显提高(P<0.05)。与模型对照组比较，养血清脑颗粒组能明显降低大鼠脑组织细胞凋亡百分率〔(11.12±3.05)%〕(P<0.05)。

3 讨 论

VD是常见的老年期痴呆，常表现为波动性病程或阶梯式恶化，疗效及预后较好，尤其是在VD早期病情不严重时，故早期诊断和治疗具有很大意义〔5〕。

本研究中模型对照组大鼠的学习记忆能力下降，与VD临床表现智能水平下降、记忆力减退一致。海马是参与空间学习记忆的重要结构，慢性脑缺血时的脑部低灌注引起的海马神经元损伤，被认为是VD进程中学习记忆能力障碍的病理基础〔6〕。

Ach是学习记忆功能的重要物质基础，脑内Ach水平下降可导致学习记忆能力下降〔7〕。AchE是Ach的水解酶，是检测Ach活性的标志。研究表明〔8〕，海马神经元功能受到损害时，AchE的活性升高；当神经元功能恢复时，AchE的活性也随之降低。本实验提示养血清脑颗粒可以通过改善胆碱能神经系统功能而改善VD大鼠学习记忆障碍。

由于脑对氧的利用高，同时又含有大量的易被氧化的不饱和脂肪酸，因此脑细胞很容易受到自由基的攻击。自由基具有破坏神经细胞膜脂质代谢、结构和导致酶失活的作用。自由基及脂质过氧化在缺血性脑损伤的发生和发展中起着重要作用〔9〕。SOD能清除超氧阴离子自由基，抑制脂质过氧化，保护细胞免受损伤，SOD活力的高低间接反映机体清除氧自由基的能力。MDA是脂质过氧化作用的终末产物，其含量可反映脂质过氧化水平，MDA的高低又间接反映机体细胞受自由基攻击的严重程度。本研究证实，模型组大鼠脑组织SOD活力降低MDA含量增高。受损脑细胞不能及时清除自由基，细胞损伤更为严重，导致正常的功能缺失，进而出现相应的神经症状，脑部的神经元变性坏死。养血清脑颗粒能够改善VD 动物模型中脑组织的自由基水平，降低自由基对脑组织的进一步损伤，改善大鼠的认知能力。

研究认为，细胞凋亡在缺血性脑损伤的病理过程中起着关键性作用〔10〕。我们应用流式细胞术对大鼠脑组织进行细胞凋亡特异性检测发现，模型组大鼠细胞凋亡比例显著多于假手术组，说明自由基对神经元造成严重损伤诱导了凋亡的发生，这一实验结果与以往文献报道基本一致。自由氧物质通过抑制线粒体电子传递链中的酶复合物导致线粒体功能障碍被认为是VD大鼠神经细胞凋亡的重要启动因素〔11〕。与模型组比较，养血清脑颗粒组大鼠脑组织神经细胞凋亡比例明显降低，说明养血清脑颗粒具有抑制细胞凋亡的作用，这种作用可能与养血清脑颗粒对脑组织内氧自由物质的清除密切相关。

基础研究证实，养血清脑颗粒可以从炎症相关基因、血管扩张相关基因、免疫相关基因等多方面影响脑基因表达谱。本研究揭示养血清脑颗粒降低VD大鼠海马区自由基水平，减轻神经细胞凋亡的发生，改善大鼠认知功能，可能是防治慢性脑缺血所致VD 的认知功能障碍的有效手段。

4 参考文献

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3杨 彬,余丽娟,王佳贝,等.前列素钠对全脑缺血/再灌注大鼠脑损伤的作用及机制〔J〕.中国药理学通报,2014;30(2)：212-6.

4张海宁,孙 莉, 汤跃宇,等.脑脉泰对慢性脑缺血致血管性痴呆大鼠脑血流量及海马神经元凋亡的影响〔J〕. 国际神经病学神经外科学杂志,2009;36(4):290-3.

5孙 冰, 吴 江, 周春奎，等.步长脑心通对慢性脑缺血致血管性痴呆大鼠认知功能及神经细胞凋亡的影响〔J〕. 吉林大学学报(医学版), 2007;33(2):219-22.

6孙 莉,吴 江,王守春,等. 慢性前脑缺血大鼠学习、记忆功能的研究〔J〕 .中风与神经疾病杂志, 2002;19(1):20-2.

7王桂华，王 敏,郭秀丽，等. 银丹心脑通软胶囊对血管性痴呆大鼠行为学及海马组织乙酰胆碱酯酶的影响〔J〕 . 中华神经医学杂志2012;11(6)：590-3.

8胡玉英，刘 泰，张青萍，等.交泰丸对血管性痴呆模型大鼠学习记忆能力及脑组织胆碱能机制的影响〔J〕.重庆医学，2012；41(3)：209-10,213,封2.

9刘春丽,陈 虹, 姜 勇，等.松果菊苷对血管性痴呆大鼠行为学、氧自由基以及胆碱能神经递质代谢速率的影响〔J〕.中国药理学通报2013；29(7)：1035-6.

10Liu G, Wang T, Wang T,etal. Effects of apoptosis-related proteins caspase-3, Bax and Bcl-2 on cerebral ischemia rats〔J〕.Biomed Rep，2013；1(6):861-7.

11Bennett SA, Tenniswood M, Chen JH,etal. Chronic cerebral hypoperfusion elicits neuronal apoptosis and behavioral impairment〔J〕 .Neuroreport, 1998；9(1):161-6.