非酒精性脂肪性肝病患者肝脏脂联素的表达与病理改变的关系

马 红 郭春花 杨香玖

(厦门大学附属中山医院内分泌科 福建医科大学厦门中山教学医院， 福建 厦门 361004)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是与肥胖密切相关的一种常见肝脏疾病〔1〕，其病理改变包括单纯性脂肪肝和脂肪性肝炎，尽管单纯性脂肪肝预后一般是良好的，但是有些病人可发展为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，后者可进一步发展为肝硬化和肝功能衰竭〔2〕。NASH的发病机制目前还不十分清楚。脂联素是脂肪细胞分泌的一种具有抗糖尿病和抗动脉硬化作用的脂肪细胞因子〔3〕。它可以增强肝脏胰岛素作用的敏感性，降低脂质在巨噬细胞的堆积及具有抗炎作用〔4～6〕。研究发现脂联素可以改善非酒精性脂肪肝NAFLD肝细胞的脂肪变性和炎症〔7〕。Aygun等〔8〕报道，合并有肝酶升高的NASH病人及炎症程度严重的NASH病人的血清脂联素水平都降低。而Mehmet等〔9〕研究发现，血清脂联素水平与NASH患者的肝脏组织学病变程度没有相关性。脂联素通过与受体结合发挥作用，脂联素受体包括脂联素受体Ⅰ和受体Ⅱ，对小鼠的研究发现，脂联素受体Ⅰ在骨骼肌含量丰富，受体Ⅱ主要在肝脏表达〔10〕。本研究检测了重度肥胖的NAFLD患者脂联素在肝脏的表达，探讨脂联素在NAFLD发病中的可能作用。

1 对象与方法

1.1一般资料 因肥胖做胃旁路减肥手术的30例患者，行肝穿刺活检诊断为NAFLD。所有病人均签署知情同意书。对这些患者均详细询问病史及体格检查，测量身高、体重，计算体重指数(BMI)。排除标准：有过量饮酒史的病人、病毒性肝炎、自身免疫性肝病、药物性肝病、肝豆状核变性、Wilson病、糖原贮积病等。生化检查包括谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、总胆红素、碱性磷酸酶(ALP)、总蛋白、白蛋白、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、甘油三酯(TG)、空腹血糖(FPG)等。

1.2组织病理学检查 对这些病人进行细针肝穿刺活检后标本送检进行常规肝脏组织学检查。由一位肝脏病理学医生根据Brunt标准〔11〕对NAFLD进行病理分级和分期。本研究中18例诊断为NASH，12例为非酒精性单纯性脂肪肝。

1.3免疫组织化学染色 对肝脏脂联素进行免疫组织化学分析。将5 μm的组织切片用二甲苯和梯度酒精进行水化，在3%的双氧水中放置30 min抑制内源性过氧化物酶活性，然后在蒸馏水中浸10 min，再将标本用抗原修复液(DaKo,CA,USA)95℃孵育30 min。滴加封闭液Power block(BioGenex,San Ramon,CA,USA)孵育5 min以消除非特异性抗原活性，然后将标本加入一抗，4℃过夜。一抗为羊抗人脂联素多克隆抗体(PBS稀释为1∶100，R&D system, Mckinley Place, MN)。将组织切片用加0.1%吐温-20的PBS液洗涤2次，然后加入生物素标记的二抗室温孵育30 min。脂联素的二抗为兔抗羊IgG(Novus Biologicals, Littleton,CO)。显色使用标记的生物素--抗生物素染色法。将标本用蒸馏水洗涤后，用苏木精复染，然后干燥，封片、镜检。由两位对患者临床资料不知情的病理科医生，用奥林帕斯BX51显微镜进行观察。标本的强度采用10个随机显微镜视野半定量方法测得。分别用1,2,3代表弱、中等、强。设置不加一抗的组织切片作为阴性对照。

2 结 果

2.1临床和生化资料 30例肥胖的NAFLD患者(NASH组18例，单纯性脂肪肝组12例)的临床和生化资料见表1。两组研究对象均为重度肥胖。两组的年龄和性别分布匹配。NASH组有7例患者并发糖尿病(38.9%)，单纯肝细胞脂肪变性组有3例糖尿病(27.3%)(P>0.05)。与单纯性脂肪肝组相比，NASH组血浆ALT水平更高(P=0.025),HDL-C水平较低(P<0.001)。其他生化指标，包括AST、ALP、总胆红素、总蛋白、白蛋白、TC、LDL-C、TG和FPG水平两组的结果均无统计学差别(表1)。

2.2肝脏病理和免疫组织化学染色结果 单纯性脂肪肝病理表现为不同程度的肝细胞脂肪变性，但无其他明显组织学改变，即无炎症、坏死和纤维化。NASH组患者的肝脏病理表现为肝细胞大泡性或以大泡性为主的混合性脂肪变性，伴有不同程度的炎性细胞浸润和纤维化(见表2)。免疫组织化学染色结果显示脂联素主要在肝血窦和门脉血管的内皮细胞表达。其表达水平在NASH患者中明显低于单纯性脂肪肝组(图1)。

表1 NAFLD患者临床和生化资料±s)

表2 肝脏病理和免疫组织化学染色结果±s)

图1 肝脏组织的脂联素免疫组化染色结果(DAB，×400)

2.3脂联素表达与肝组织病理变化的相关性 Spearman相关分析结果显示脂联素的表达强度与肝细胞的炎症程度呈负相关(r=-0.368,P=0.045),与纤维化程度也呈负相关(r=-0.380，P=0.038)。脂联素表达与肝细胞脂肪含量百分比的相关系数为-0.31(P<0.09)。脂联素表达与HDL-C浓度及其他生化指标无相关性。

3 讨 论

本研究结果表明在肥胖的NAFLD患者中，与单纯性脂肪肝组的患者相比，NASH组脂联素在肝脏的表达明显降低。脂联素在肝脏的表达水平与肝组织炎性细胞浸润程度、纤维化程度呈负相关。

Hui等〔12〕研究发现NAFLD组血清脂联素浓度低于单纯性脂肪肝组，而且血清脂联素水平与肝细胞脂肪变性程度和炎症程度独立相关，但与纤维化程度无相关性。在另一项研究中，Bugianesi等〔13〕发现NAFLD患者与对照组相比，其血浆脂联素浓度明显下降，脂联素水平的降低与肝细胞脂肪含量有明显的相关性，但与肝细胞的炎症程度和纤维化程度并不相关。钟炳武等〔14〕的研究表明在肥胖患者中，血清脂联素水平正常，与收缩压、HDL-C 相关。有研究显示在用CCl4处理过的小鼠肝脏中GBP28/脂联素的表达明显升高，该结果提示脂联素在肝脏的组织损伤和炎症反应的修复过程中起一定作用〔15〕。另一项在NAFLD患者的研究中，发现NAFLD患者脂联素和脂联素受体Ⅱ在肝脏的表达水平比单纯性脂肪肝患者明显降低〔16〕。本研究结果表明，在肥胖的NAFLD患者中，NAFLD组脂联素在肝脏的表达比单纯性脂肪肝组明显下降。

本实验结果提示肝脏的脂联素不是由肝脏产生，而是从血循环中摄取来的。因此，有理由认为肝脏的脂联素表达水平与血循环中的脂联素浓度是有相关性的。本研究结果没有测定患者的血清脂联素水平，这是本研究的一个不足之处。而Kaser等〔17〕在对NAFLD病人的研究中，没有发现血清脂联素与肝脏脂联素mRNA表达的相关性。当然，这是一个基于小样本的研究得出的结论。脂联素在肝脏表达的调控因素还需要进一步深入的研究。

本研究中Spearman相关分析结果表明脂联素的表达强度与肝脏的炎症程度和纤维化程度呈负相关，说明脂联素在肝脏的表达与非酒精性脂肪肝肝脏病理变化有关。有多项研究提示脂联素有抗炎〔6〕和抗纤维化的作用〔17〕。脂联素通过抑制NF-κB的活性发挥抗炎作用〔18〕，通过降低转移生长因子(TGF)在肝脏卫星细胞的表达来抑制四氯化碳引起的肝脏纤维化〔17〕。本结果提示，在NAFLD患者中脂联素表达下降，可能使其抗炎、抗纤维化作用减弱。

本研究还发现血HDL-C水平在NASH组是明显下降的。有研究表明，脂联素与脂代谢紊乱密切相关，血浆脂联素浓度与HDL-C水平正相关〔19〕。最近，Fumihiko等〔20〕报道脂联素可以通过增加ABCA1旁路和apoA-1在肝脏的合成提高HDL水平。本研究中没有发现脂联素表达与HDL-胆固醇的相关性，可能与样本量较少有关。

总之，本研究结果提示肥胖患者，脂联素在肝脏表达水平的下降可能在NAFLD特别是从单纯性脂肪肝到NASH的进展中起一定作用。

4 参考文献

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