MCT1 CD147在人胶质瘤中的表达与预后的相关性

韩 松 董 韬 于春泳 曹 鹏 潘冬生 魏学忠 冯思哲

沈阳军区总医院神经外科 沈阳 110016



·论著·

MCT1 CD147在人胶质瘤中的表达与预后的相关性

韩 松 董 韬 于春泳 曹 鹏 潘冬生 魏学忠 冯思哲△

沈阳军区总医院神经外科 沈阳 110016

目的 探讨MCT1、CD147在人胶质瘤中的表达及其与预后的相关性，分析其作为胶质瘤预后判断指标及药物治疗靶点的可能性。方法 本文采用实时荧光定量PCR和western blotting方法检测MCT1和CD147在不同级别胶质瘤及正常组织中的表达情况，并利用生存曲线对患者的生存预后进行分析。 结果 MCT1和CD47在人胶质瘤患者组织中均高表达，且高级别胶质瘤患者MCT1和CD147表达与低级别胶质瘤患者差异有统计学意义(P<0.05)，低级别胶质瘤患者MCT1和CD147与正常组织表达差异统计学意义(P<0.05)。不同级别胶质瘤患者与正常对照组MCT1和CD147表达生存相关曲线差异有统计学意义(P<0.05)。结论 MCT1和CD47是神经胶质瘤恶性程度的重要标志物，且二者可以作为胶质瘤预后判断的指标参考及药物治疗的靶点。

MCT1；CD147；胶质瘤；预后；相关性

胶质瘤又称神经胶质瘤，多发生于神经外胚层，具有生长迅速、侵袭能力强以及容易复发等特点[1-2]。胶质瘤是颅内肿瘤最常见的一种，可根据其生物学特征采用磁共振、超声波、放射学核素进行定位，准确率几乎达到100%，但是目前对胶质瘤，尤其是高级别的神经胶质瘤治疗效果不甚理想。MCT1是一种跨膜蛋白，存在于多种肿瘤组织中，对乳酸具有较高的亲和力，主要在乳酸的细胞跨膜运输中起作用[3-4]。CD147蛋白可以辅助MCT1在细胞膜上正确定位，参与其形成正确的结构，且在多种肿瘤发生及侵袭中发挥作用[5-6]。本文旨在探讨MCT1、CD147在人胶质瘤中的表达及其与预后的相关性，为临床相关肿瘤的诊断及治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 本文选取我院2008-03—2011-03经过病理切片及免疫组织化学证实的50例胶质瘤患者标本进行研究。其中低级别胶质瘤14例(包括少突胶质细胞瘤5例，Ⅰ/Ⅱ级星形细胞瘤9例)，高级别胶质瘤36例(包括间变性星形细胞瘤8例，Ⅲ/Ⅳ级星形细胞瘤16例，多形性细胞胶质瘤12例)。

1.2 试剂与仪器 CD147鼠抗人单克隆抗体、MCT1 鼠抗人单克隆抗体购自SANTA公司。S-P免疫组化试剂盒，DAB显色试剂盒购自北京中山生物有限公司。CK40相差显微镜为OLYMPUS产品。高纯总RNA 提取试剂盒、TRIzol、氯仿均购自BioTek公司，qRT-PCR的逆转录酶M-MLV 第一链合成系统购自Invitrogen 公司，引物管家基因β-actin、目的基因(MCT1、CD147)、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ购自TaKaRa 公司。基因引物序列见表1。

表1 CD147及MCT1引物序列及扩增长度

1.3 实时荧光定量PCR qRT-PCR(罗氏LightCycler480实时荧光PCR系统)的扩增体系：2×qPCR Mix 5 μL，上游和下游引物各10 pmol，模板cDNA 2 μL，dH2O 1 μL，共10 μL。反应条件：95℃10 s，60℃ 40 s，共28个循环。通过2%琼脂糖凝胶电泳及熔解曲线鉴定qRT-PCR产物，并用公式(ΔCt) 进行定量分析。ΔCt=目的基因Ct-内参基因Ct。

1.4 Western Blotting分析 肿瘤组织和正常组织充分匀浆，考马斯亮蓝法蛋白定量后以等量蛋白进行SDS-PAGE和半干法转膜。转至硝酸纤维素膜上后5%脱脂牛奶封闭2 h。然后与一抗温孵过夜，PBS漂洗3次后与HRP标记二抗(1：200)室温反应1 h，显色。用凝胶成像分析系统测定光密度，以β-actin作为参照，进行蛋白表达的定量分析。

2 结果与分析

2.1 q-PCR分析MCT1和CD147在不同级别胶质瘤组织中表达的差异 q-PCR检测发现，MCT1和CD147在不同级别胶质瘤组织中表达差异有统计学意义(P<0.05)，在高级别胶质瘤中表达最强，而正常组织中表达最弱，见表2。

表2 q-PCR分析MCT1和CD147在不同级别 胶质瘤组织中mRNA表达的差异(△Ct)

注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与低级别神经胶质瘤组相比，$P<0.05

2.2 Western Blotting分析MCT1和CD147在不同级别胶质瘤组织中表达的差异 Western Blotting检测发现，MCT1和CD147蛋白在不同级别胶质瘤组织中表达差异具有统计学意义(P<0.05)，且在高级别胶质瘤中表达最强，而正常组织中表达最弱，见图1、图2。

图1 Western Blotting检测不同组织中MCT1蛋白的表达

图2 Western Blotting检测不同组织中CD147蛋白的表达

2.3 MCT1和CD47与胶质瘤患者术后生存与预后的相关性 50例患者均在术后进行随访，并依据随访数据分别绘制MCT1阳性组(高表达组患者+低表达组患者)、对照组患者和CD147阳性组(高表达组患者+低表达组患者)及对照组患者的Kaplan-Meier生存曲线。通过比较发现，MCT1和CD147蛋白阳性表达组患者曲线基本全程位于对照组曲线下部(图3)。MCT1阳性表达组与对照组生存率分布差异有统计学意义(P<0.01)，CD147阳性组和对照组差异有统计学意义(P<0.01)。

图3 MCT1(A)和CD147(B)高阳性、低阳性及对照组生存曲线

3 讨论

世界范围内恶性肿瘤的发生率和病死率有逐年升高趋势，给人类生活质量和医疗事业带来巨大的不利影响。研究表明，各种恶性肿瘤组织在氧气充足的情况下主要依靠糖酵解供应能量，而糖酵解过程却产生大量乳酸。如果乳酸的转运速率与产生的速率不能同步，则会引起细胞内pH值明显降低，最终会导致肿瘤细胞的功能丧失，导致细胞的凋亡、死亡。

MCTs家族在直肠癌、乳腺癌以及卵巢癌等实体肿瘤中均有表达，且MCT1表达较高。MCT1是一种跨膜蛋白，主要在乳酸的转运过程中发挥作用，肿瘤细胞通过MCT蛋白将细胞内的乳酸转移到癌旁组织来维持肿瘤细胞内正常的pH值，维护细胞的正常生理功能和活性[7-8]。如果多余的乳酸未及时转运出细胞，细胞酸化将明显抑制糖酵解的反应方向与速度，加剧细胞的酸化并最终引起细胞死亡。Sonveaux研究表明，肿瘤细胞的灭活可以通过抑制MCT1蛋白的表达来实现，具有明显的临床意义[9]。本研究发现，高级别神经胶质瘤中MCT1的mRNA和蛋白质表达比低级别神经胶质瘤组织中MCT1的表达更高，同时高级别神经胶质瘤生存曲线均位于低级别神经胶质瘤患者生存曲线。因此，MCT1可作为胶质瘤预后判断的指标参考及药物治疗的靶点。

MCT1进入细胞膜上的正确位点，形成跨膜通道并建立乳酸转运的生理功能必须依赖于细胞膜上的CD147蛋白的引导[10-11]。CD147是细胞表面的黏附分子，具有诱导肿瘤组织侵袭、协助MCT蛋白表达等多种生理功能。CD147蛋白是MCT蛋白进行乳酸转运和维系肿瘤细胞内环境酸碱平衡的重要分子。有研究表明，CD147在恶性肿瘤组织细胞膜上有较强的表达[12-13]，但在正常组织中表达几乎为零。本研究发现，在神经胶质瘤组织中，CD147具有较高的表达，同时正常组织中也有微弱的表达。同时我们也发现，高级别神经胶质瘤生存曲线均位于低级别神经胶质瘤患者生存曲线。因此，CD147也可作为胶质瘤预后判断的指标参考及药物治疗的靶点。

本研究发现，MCT1、CD 47 mRNA和蛋白质在人胶质瘤患者组织中均高表达，且高级别胶质瘤患者MCT1和CD147表达与低级别胶质瘤患者差异有统计学意义(P<0.01)，低级别胶质瘤患者MCT1和CD147与正常患者表达差异有统计学意义(P<0.01)。MCT1和CD147表达生存相关曲线差异有统计学意义。因此，MCT1和CD47是胶质瘤恶性程度的重要标志物，且二者可以作为胶质瘤预后判断的指标参考及药物治疗的靶点。

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(收稿2013-10-10)

Expressions of MCT1 and CD147 in human gliomas and their correlations with prognosis

HanSong,DongTao,YuChunyong,CaoPeng,PanDongsheng,WeiXuezhong,FengSizhe

DepartmentofNeurosurgery,theGeneralHospitalofShenyangMilitaryRegion,Shenyang110016,China

Objective To investigate the expression and prognostic significance of MCT1, CD147 in human gliomas and analyze the possibility of glioma prognosis as drug targets. Methods The expression of CD147 and MCT1 were detected by real-time PCR and Western blotting in different grade of glioma and normal tissues. And the prognosis of patients with survival curve was also analyzed. Results The expression of MCT1 and CD47 in human glioma patients showed high density. And the expression of MCT1 and CD147 in high grade glioma was significantly different with that in low level grade glioma (P<0.05). the expression of MCT1 and CD147 in different grades of glioma patients and normal control group had significant difference in survival curve. Conclusion MCT1 and CD47 are important signs of malignancy of neuro-glioma, and the two dictators can be used as a target for drug treatment and judging the prognosis of it.

MCT1; CD147; Glioma; Prognosis;Correlation

R730.264

A

1673-5110(2014)01-0001-03

△通讯作者：冯思哲，副主任医师，E-mail：qkzztg123@163.com