慢性乙型肝炎患者外周血抗原特异性CD8+T细胞功能的初步分析

蔡 刚，吴蓓颖，范臻佳，沈 茜

(1.上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科，上海 200025;2.第二军医大学附属长海医院实验诊断科，上海 200433)

尽管伴随大规模疫苗接种，我国乙型病毒性肝炎的发病率已明显下降，但就全世界范围而言，我国仍是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)的重度流行区域之一。在感染 HBV后，超过90%的成人可从急性感染自愈，并获得终生免疫保护，但少数急性患者及儿童患者常进展为慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)，并可能最终导致肝硬化和原发性肝癌等严重肝脏疾病[1]。早期的研究发现，与急性自限性感染患者不同，慢性感染患者普遍存在T细胞功能缺陷，这被认为是病毒难以清除的主要原因[2]。随后多项研究证实，病毒抗原持续刺激所致的抗原特异性T细胞功能耗竭是造成T细胞功能缺陷的重要原因[3]。更进一步的研究发现，这种抗原特异性T细胞功能耗竭的现象不仅出现在多种慢性感染性疾病中，同时也出现在肿瘤的免疫病理过程中[4]。

鉴于抗原特异性T细胞在清除病毒及肿瘤细胞方面具有关键作用，其功能可能与这些慢性病毒性感染性疾病或肿瘤的预后密切相关，目前对这方面的研究愈趋重视。人类白细胞相关抗原(human leukocyte antigen，HLA)限制性多肽(或称之为抗原表位)存在于HBV蛋白质抗原的多肽链中。目前在HBV特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)识别的21个HBV抗原表位中，有16个是HLA-A2限制性的[5]。此外HLA-A*2402是我国人口中常见的HLA-Ⅰ型等位基因之一[6]。HBV特异性CTL可以识别主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex，MHC)-Ⅰ类分子与细胞内合成的病毒蛋白肽复合物，通过对病毒相关抗原表位的识别、活化，经穿孔素、颗粒酶依赖的途径杀伤感染肝细胞，或通过Fas/FasL途径启动靶细胞的凋亡，以及通过细胞因子如γ干扰素(interferongamma，IFN-γ)等的非细胞杀伤途径抑制病毒的复制。在本研究中，我们利用MHC四聚体标记技术对CHB患者外周血中HBV抗原特异性CD8+T细胞的数量和功能进行了初步分析，并观察其与临床指标的联系。

材料和方法

一、研究对象

经临床确诊的CHB患者35例，男26例，女9例，年龄22～79岁，中位数45岁，诊断标准依据2010版国家“慢性乙肝防治指南”[7]。所有研究对象的HLA-A等位基因均为A02或A24。所有患者在受试前6个月内均未进行过抗病毒治疗或IFN治疗，均排除同时感染丙型、丁型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)等。

二、方法

1.试剂及抗体 藻红蛋白(phycoerythrin，PE)标记HLA-A2402与HBV核心(core)117～125抗原肽(EYLVSFGVW)或HBV聚合酶(pol)756～764抗原肽(KYTSFPWLL)四聚体(Tetra)复合物，PE标记HLA-A0201和HBV core18～27抗原肽 (FLPSDFFPSV)或HBV包膜(env)335～343抗原肽(WLSLLVPFV或env348～357 GLSPTVWLSV)四聚体复合物均购自Proimmune公司;多甲藻叶绿素蛋白(peridinin chlorophyll protein，PerCP)-Cy5.5-抗 CD19、异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)-抗白细胞介素2(interleukin 2，IL-2)、别藻红蛋白(allophycocyanin，APC)-抗 IFN-γ 和 APC-Cy7-抗 CD8 抗体购自BioLegend和BD-pharmingen公司;高尔基体阻断剂布雷菲德菌素A购自eBioscience公司;穿膜剂saponin购自Invitrogen公司;离子霉素和佛波醇酯购于Sigma公司。淋巴细胞分离液购自上海精华试剂厂。

2.流式细胞术分析 10 mL肝素抗凝静脉血经淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)后，1 ×106个PBMC先加入2 μL四聚体进行标记，室温作用1 h。四聚体标记结束后，细胞使用磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline，PBS)洗涤。进一步标记 PerCP-Cy5.5-抗CD19或 APC-Cy7-抗 CD8针对膜抗原的抗体，室温温育30 min，PBS洗涤。需进行胞内细胞因子抗原检测的，PBMC先以终浓度1 μg/mL离子霉素和50 ng/mL佛波醇酯进行刺激5 h，刺激同时添加终浓度为10 μg/mL布雷菲德菌素A。细胞先标记四聚体和膜抗原，洗涤后细胞再加入固定穿膜剂500 μL后，4℃作用过夜。PBS洗涤后，加入FITC-抗 IL-2或APC-抗IFN-γ抗体，室温孵育30 min。洗涤后，采用BD公司CantoII流式细胞仪收集细胞，Diva软件进行数据分析。

3.其他指标测定 血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)的测定在 Beckman Coulter UniCel®DxC800系统上完成;HBV表面抗原(hehpatitis B surface antigens，HBsAg)等指标的测定在雅培ARCHITECT PLUS i2000系统上完成;血清HBV DNA载量测定采用实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)，试剂购于深圳凯杰公司，最低检出限为500 IU/mL。

三、统计学方法

采用Prism5.0软件进行统计学分析。PBMC四聚体标记阳性细胞患者组与阴性患者组之间比较采用秩和检验，抗原特异性CD8+T细胞与总CD8+T细胞的比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、CHB患者外周血HBV特异性CD8+T细胞的确定

由于MHC-抗原肽四聚体与淋巴细胞有一定的非特异性结合，因此我们通过对携带HLA-A02或HLA-24等位基因的正常人PBMC进行标记，以CD19－细胞设门，确定以CD8+Tetra+/CD8+≤0.01%作为HBV特异性CD8+T细胞检出的Cutoff值，因为所有正常供者对照 CD8+Tetra+/CD8+≤0.01%。在全部35例CHB患者中，共有9例检出针对不同抗原肽抗原特异性CD8+T细胞的病例，其 CD8+Tetra+/CD8+＞0.01%(0.33% ～2.14%，中位数为0.95%)。见图1。

图1 采用流式细胞仪和四聚体技术检测CHB患者外周血HBV抗原特异性CD8+T细胞的典型图

二、CHB患者外周血HBV特异性CD8+T细胞效应功能分析

采用胞内细胞因子染色、流式细胞仪分析技术分析HBV抗原特异性CD8+T细胞IL-2和IFN-γ的分泌能力。结果显示，HBV抗原特异性CD8+T细胞IL-2和IFN-γ的分泌能力均显著低于患者自身的外周血总CD8+T细胞(P＜0.01)，强烈提示HBV抗原特异性CD8+T细胞存在功能缺陷，见图2。然而，对比检出HBV抗原特异性CD8+T细胞患者与未检出HBV抗原特异性CD8+T细胞患者的外周血总CD8+T细胞IL-2和IFN-γ的分泌能力，差异无统计学意义(P＞0.05)，见图2。

三、CHB患者外周血HBV抗原特异性CD8+T细胞检出水平与ALT及HBV DNA载量的关系

对CHB患者外周血HBV抗原特异性CD8+T细胞进行初步功能分析后再对比HBV抗原特异性CD8+T细胞阳性患者与阴性患者血清ALT和外周血病毒载量(HBV DNA)的水平。结果显示，HBV抗原特异性CD8+T细胞阳性患者血清ALT水平明显高于阴性患者(P＜0.05)，HBV DNA载量则显著低于阴性患者(P＜0.01)，见图3。这一结果提示在HBV抗原特异性细胞阳性患者中可能存在较强的抗病毒免疫反应。

图2 HBV抗原特异性CD8+T细胞检出患者(9例)和未检出患者(26例)外周血抗原特异性CD8+T细胞和总CD8+T细胞的细胞因子表达分析

图3 HBV抗原特异性CD8+T细胞检出患者(9例)和未检出患者(26例)血清ALT和HBV DNA水平比较

讨 论

HBV感染的临床转归与机体免疫密切相关，其中细胞免疫，尤其是HBV特异性CTL在病毒清除过程中起着重要的作用。但是，研究发现HBV慢性感染者体内HBV特异性CTL存在数量和质量上的缺陷，不能有效地清除病毒。在慢性期抗病毒T细胞反应与急性期状态存在明显不同。急性感染条件下，抗原特异性T细胞活化后，其最终命运有2种可能，一是成为终末分化的效应细胞，二是成为前体记忆细胞[8]。然而，在慢性感染条件下，无论是在动物模型还是人类疾病，抗原特异性效应T细胞功能失调都是一种普遍的现象。持续的病毒刺激造成功能耗竭是效应T细胞功能失调的重要原因[3]。在多项研究中已经证实，程序性死亡蛋白1(programmed death-1，PD-1)和B、T淋巴细胞弱化因子(B and T lymphocyte attenuator，BTLA)不仅是T细胞耗竭状态的重要表面标志，亦是导致效应T细胞耗竭的重要效应分子[9]。研究证实CHB患者外周血和肝内CD8+T细胞表达PD-1、BTLA(CD8+PD-1+BTLA+)的比例均显著高于正常对照组及疾病对照组，CD8+PD-1+BTLA+T细胞分泌 IL-2和 IFN-γ的水平显著低于CD8+PD-1－BTLA－T细胞;单独阻断或联合阻断上述分子能有效地恢复CD8+T细胞的效应功能，包括促细胞增殖、细胞因子分泌[10]。本研究发现CHB患者外周血HBV抗原特异性CD8+T细胞IL-2和IFN-γ的分泌能亦显著低于患者自身的外周血总CD8+T细胞。该结果更为明确的证实了CHB感染条件下，抗病毒T细胞效应功能存在明显的缺陷。

尽管本研究证实CHB患者HBV抗原特异性CD8+T细胞的功能存在明显缺陷，然而HBV抗原特异性CD8+T细胞阳性患者血清ALT的水平明显高于阴性患者(P＜0.05)，HBV DNA载量则显著低于阴性患者(P＜0.01)。这些结果提示，HBV抗原特异性CD8+T细胞在外周血的出现，表明这些患者体内存在较为激烈的抗病毒免疫反应，体现为HBV抗原特异性T细胞检出阳性患者的HBV病毒载量较检出阴性患者低，同时其肝功能活动性损伤亦较为严重。有研究显示，急性乙型肝炎患者外周血HBV抗原特异性CD8+T细胞的检出率明显高于慢性乙型肝炎患者，HBV抗原特异性CD8+T细胞百分率高的患者血清HBV DNA和HBV e抗原的清除要早于HBV抗原特异性CD8+T细胞百分率低的患者，表明HBV抗原特异性CD8+T细胞在病毒的清除和疾病的自限过程中起重要作用[11]。HBV抗原特异性CD8+T细胞究竟对CHB患者疾病的转归有何影响，还需进行长期的随访观察。

综上所述，本研究初步分析了CHB患者外周血抗原特异性CD8+T细胞的功能特点及与相关临床指标的关系。对于象CHB这样的慢性感染性疾病，对病毒特异性T细胞进行功能分析，可能不仅有助于判断疾病的进程、预测转归，更有利于认识感染条件下免疫系统与病毒之间的相互作用，为通过调节免疫功能，治疗CHB等慢性感染性疾病，甚至肿瘤等提供新的思路。

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