Leptin在乳腺癌中的表达及其临床病理学意义

陈晓泉，黄山平，陆建荣，张 娟，丁彩霞

（陕西省肿瘤医院病理科，陕西 西安710061）

乳腺癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一，占全球女性癌症的23%，在发达国家这一比例甚至达27%，发病人数至少是其他肿瘤的两倍［1］。Leptin是由肥胖基因（ob）编码的一种蛋白质产物。由167个氨基酸组成，成熟后的leptin为146个氨基酸残基，分子量约16KD［2］。leptin具有促进细胞增殖分化、增加细胞侵袭性、促进血管形成和调节机体免疫等作用，与肿瘤的发生密切相关［3-4］。本研究通过检测leptin在乳腺癌中的表达，初步探讨leptin与乳腺癌发生的关系及其调控机制，为乳腺癌的预防及治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

收集陕西省肿瘤医院2011-07～2012-12手术切除的乳腺癌标本150例，年龄28～73岁，中位年龄45.5岁。根据世界卫生组织（WHO）乳腺肿瘤病理学分类，其中非特殊性浸润性导管癌87例，浸润性小叶癌41例，其他少见类型乳腺癌22例；根据乳腺癌TNM分期标准，I期14例，Ⅱ期37例，Ⅲ期61例，Ⅳ期38例。另收集乳腺增生病组织30例。

1.2 方法

1.2.1 乳腺癌组织切片的预处理 将含有乳腺癌组织的蜡块5μm厚度切片，65℃烤片过夜，然后经二甲苯及100%乙醇、85%乙醇和70%乙醇中各5 min脱蜡；90℃蒸馏水30 min，处理完毕后将玻片置于37℃蛋白酶K（0.4 g/L，2×SSC）溶液中消化10 min；室温下于2×SSC（pH7.0）溶液中漂洗玻片2次，每次5 min；最后将玻片依次置于70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中各2 min脱水，自然干燥玻片。

1.2.2 免疫组化检测leptin蛋白及Ki67的表达99℃抗原修复液修复40 min，室温冷却20 min，过氧化物酶阻断剂作用5 min。每张切片滴加一抗50μl（抗鼠leptin，SantaCraz；抗鼠Ki67，迈新公司），室温孵育30 min；TBST洗涤5 minx2次；室温与二抗（辣根过氧化物酶联羊抗鼠/兔抗体，迈新）反应30 min，TBST洗涤5minx2次；DAB染色，梯度乙醇脱水，二甲苯清洗，DPX封片。

1.2.3 结果判读leptin的着色强度按下列标准评定［5］不着色为0分；着色弱者为1分；着色强度介于弱和强之间者为2分；着色强者为3分。染色的阳性细胞所占比例评定标准为：选择5～10个高倍视野，计算1000个肿瘤细胞中阳性细胞的百分率，阳性细胞数＜5%为阴性（0分）；5% ～25%为弱阳性（1分）；26%～50%者为阳性（2分）；51% ～75%者为强阳性（3分）；＞75%者为极强阳性（4分）。两种评分相加，将结果分为4个等级，0～1分为阴性（-）；2分为阳性（1+）；3～4分为强阳性（2+）；5～7分为极强阳性（3+）。

1.2.4 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件分析，计数资料用χ2检验进行蛋白表达状态分析，所有统计结果均认为P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Leptin在乳腺癌组织中的表达及其与Ki67间的相关性

Ki67着色部位定位于细胞核内。leptin正常表达主要定位于细胞质，以出现淡黄色或棕黄色颗粒为阳性细胞标志。结果显示leptin在乳腺增生病中有少量表达（20%），在本组乳腺癌组织中68例表现出不同程度的leptin蛋白胞浆染色（图1），其中IHC3+的15例，IHC2+的病例26例，IHC1+的病例27例，阳性率为45.3%，与乳腺增生病比较二者差异有统计学意义（P＜0.05）；且Leptin的表达随Ki67增殖指数的增高而阳性率显著升高，二者呈正相关（图1，表1），差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图1 （IHC）leptin在乳腺癌组织细胞浆棕黄色着色，Leptin的表达与Ki67增殖指数呈正相关

表1 乳腺癌组织中Leptin的表达与Ki67增殖指数间的相关性

表2 leptin在乳腺增生病及乳腺癌中的表达

2.2 乳腺癌组织leptin表达与临床病理学特征间的关系

有淋巴结转移的51例乳腺癌患者中leptin蛋白阳性表达率为62.75%（32/51），明显高于无淋巴结转移的病例中leptin的阳性表达率36.36%（36/99），表明leptin蛋白阳性率与乳腺癌淋巴结转移呈正相关，差异有统计学意义（P＜0.05）；leptin的阳性表达与肿瘤的组织学类型、肿瘤的体积、TNM分期及是否绝经无相关性（表3）。

3 讨论

leptin是由肥胖基因（ob）编码的一种蛋白质产物。由167个氨基酸组成，其氨基端为由21个氨基酸组成的信号肽，在分泌到血液的过程中，切除信号肽形成leptin［6］。作为蛋白质激素，leptin的多种生物学作用是通过靶细胞膜上的leptin受体LR和相应信号转导系统实现的［7］。研究发现，leptin相关的细胞内信号传输途径主要包括［8-10］：（1）JAK激酶/信号传输与转录活化子途径；（2）丝裂原活化的蛋白激酶途径；（3）磷脂酰肌醇-3激酶信号通路；以及其他可能的信号通路如C-AMP激活蛋白激酶、STAT3激活过氧化物酶体增殖物激活受体2α等参与细胞功能的调节。leptin具有促进细胞增殖分化、增加细胞侵袭性、促进血管形成和调节机体免疫等作用，故推测leptin与肿瘤的发生有关。

表3 乳腺癌组织leptin表达与临床病理学特征间的关系

在人类正常乳腺的发育过程中，leptin是必不可少的，同时leptin与乳腺癌的发生相关。体外研究发现，leptin可使乳腺上皮细胞（HBL100细胞）和乳腺癌细胞（T47D细胞）的数量增长，增长率分别为50%和13.8%，其受体在两种细胞上均有表达，说明leptin可引起乳腺细胞的增生和乳腺癌的发生［11］。Okumura等［12］检测了leptin对MCF-7人类乳腺癌细胞有丝分裂时间、DNA复合酶、细胞周期相关蛋白的水平和蛋白激酶C（PKC）的影响，结果提示高leptin血症能够通过加速乳腺癌细胞的生长周期而促进肿瘤细胞生长。有研究发现，在正常组织和乳癌上皮组织以及乳癌细胞中leptin均有表达，且在癌组织中有明显的过表达［13］。本实验用免疫组织化学方法检测，发现在乳腺癌及乳腺增生病组织中均有leptin受体表达，但乳腺癌leptin受体阳性率（68/150，45.3%）高于乳腺增生病组织（6/30，20%），差异具有显著性。这一结果进一步证实了leptin在乳腺癌的发生和发展中起着重要的作用，推测Leptin在乳腺癌组织的普遍性表达，会提高乳腺癌细胞对leptin受体的敏感性，使乳腺癌细胞更易受leptin生物学作用的影响。Ki67是一个可靠而迅速反映恶性肿瘤增殖率的指标，已被广泛应用于肿瘤的增殖细胞动力学研究，其高表达是细胞增殖活跃的重要标志，Filippella等认为Ki67是预测肿瘤侵袭、复发的最好指标［14］。研究显示在侵袭性垂体腺瘤中leptin与Ki67之间存在正趋势，在大肠腺癌中leptin受体也与Ki67呈正相关［15］。本研究结果显示leptin的表达与Ki67增殖指数正相关，提示leptin在乳腺癌中的表达与其肿瘤细胞的增殖密切相关。与以往的报道相似［16］，本研究发现淋巴结转移组的表达明显高于无淋巴结转移组，差异具有显著性（P＜0.05），表明Leptin与肿瘤的生长与转移有关。Mantzoros等［17］对绝经前妇女进行leptin与乳腺癌的流行病学调查，结果显示leptin并未提高绝经前妇女乳腺癌的发生概率。而Petridou［18］则认为，绝经前妇女的leptin水平与乳腺癌发生的危险性呈负相关。Ozet［19］等报道，乳腺癌患者血清leptin水平明显高于对照组，绝经前后无显著性差异，且与疾病的发展阶段无关。此外，有研究显示leptin的表达与乳腺癌TNM分期呈正相关［20］，本研究未发现leptin受体的表达与乳腺癌分化程度、肿瘤分期及是否绝经等临床病理参数之间有相关性，可能是因为本研究所收集的样本量较少，今后需要增加样本量以取得更满意的研究结果。

总之，上述研究结果表明leptin参与了乳腺癌的发生、发展，可以为我们诊断乳腺癌提供新的辅助手段，提示作为一个潜在的靶点，在肿瘤的综合治疗方案中，leptin及其受体也许能找到一席之地。

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