棉酚衍生物ApoG2诱导胃癌细胞凋亡及对Wnt6调控作用的研究

李天晓 元刚 叶丽君 孙健 黎曙霞

胃癌是世界范围难治性肿瘤之一。诱导肿瘤细胞凋亡是研发抗癌药的目标之一，棉酚衍生物ApoG2是针对细胞凋亡调节因子Bcl2蛋白家族中抗凋亡蛋白结构开发出的新型棉酚衍生物，能够拮抗Bcl2抗凋亡作用，释放促凋亡蛋白Bax和Bak，启动细胞凋亡程序[1］。目前ApoG2抗肿瘤能力已被广泛证明，ApoG2不仅能影响Bcl2家族的表达激活线粒体凋亡通路，也能通过诱导内质网应激凋亡、细胞自噬等其他途径引起肿瘤细胞死亡，提示ApoG2可能激活多条抑癌通路[2-4］。近来发现WNT信号通路在消化道系统肿瘤发生过程中扮演了重要角色。胃上皮组织Wnt/β-catenin通路的激活可直接引起肿瘤的形成[5］。Wnt6是WNT家族重要成员，参与调控细胞活动，包括细胞增殖、分化和迁移，在肿瘤细胞中高度表达，并且介导了胃癌细胞对化学治疗的抵抗性[6-7］。WNT与Bcl2信号通路存在广泛的相互作用[8-9］。有研究发现ApoG2能显著下调WNT信号靶基因c-Myc和细胞周期蛋白cyclin D1的表达，但ApoG2对WNT蛋白家族的影响尚未见报道[10］。本研究以人胃腺癌细胞株BGC823为模型研究ApoG2诱导胃癌细胞凋亡的作用，并检测ApoG2对Bcl2家族及Wnt6表达的影响，进一步探讨ApoG2抗肿瘤机制和应用前景，现报告如下。

材料与方法

一、细胞与试剂

人胃癌细胞株BGC823由中山大学附属第一医院消化内科实验室馈赠，培养于完全培养基[含10%胎牛血清（Gibco，美国）、100 kU/L青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI1640培养基（Gibco，美国）］，培养环境37℃，5% CO2。ApoG2由上海亚盛医药科技有限公司杨大俊教授馈赠，溶解于二甲亚砜（MP Biomedicals，美国）配成20 mmol/L储存液，-20℃保存。

二、方 法

1.ApoG2对胃癌细胞BGC823生长抑制作用的检测

采用噻唑蓝（MTT）法。消化对数生长期的胃癌细胞BGC823，以培养液稀释成终浓度为1×105/ml的单细胞悬液，每孔100μl接种于96孔培养板中，待细胞贴壁后弃去培养液，用不含血清的培养基梯度稀释ApoG2母液至不同浓度（终浓度为10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125μmol/L），加入培养孔中，每个浓度设3个复孔，对照组和调零组加入含0.1% 二甲亚砜培养基，其中调零组不接种细胞。分别培养24、48、72 h后，每孔加入5 g/L MTT溶液（MP Biomedicals，美国）20μl，继续培养4 h后小心吸弃孔内溶液，加入二甲亚砜溶解结晶物，用酶标仪 （Thermo Multiskan GO，美国）检测各孔在490 nm处的吸光度（OD），记录OD值。细胞生长抑制率（%） = [1- （OD试验组-OD调零组）/（OD对照组-OD调零组）]×100%。半数抑制浓度（IC50）指与对照组比较抑制50%细胞生长的药物浓度。

2.药物干预

根据MTT实验的结果，ApoG2处理24、48、72 h均对细胞有较明显的生长抑制作用，选取48 h作为药物干预时间，选取给药浓度中最接近48 h IC50值的1.25μmol/L，2倍的IC50值2.5μmol/L和4倍的IC50值5μmol/L作为药物干预浓度。经消化的细胞用完全培养基重悬稀释接种于6孔板，细胞贴壁后分别用0.1% 二甲亚砜或1.25、2.5、5μmol/L ApoG2处理细胞48 h，进行后续实验。

3.细胞凋亡形态的检测

经消化的细胞用完全培养基稀释至105/ml接种于6孔板内，每孔2 ml，培养过夜。按前述方法给药48 h后，弃去培养基，按Hoechst33258染色试剂盒（碧云天，中国）说明书固定并染色。荧光显微镜（ZEISS Axio Imager Z1，德国）下观察拍照。激发波长350 nm，发射波长460 nm。

4.细胞周期分析

将2×105/ml细胞悬液接种于6孔培养板，每孔2 ml，培养过夜。按前述方法给药48 h后，用0.25%的胰蛋白酶消化收集细胞，加入预冷70%乙醇4℃固定过夜。弃固定液后用预冷磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤1次，用配好的DNA染色液[含0.2% Triton-X-100，RNase 100μg/ml，碘化丙啶（PI）50μg/ml］重悬细胞沉淀，37℃避光染色30 min，上流式细胞仪（Beckman Coulter FC500，美国）检测细胞周期。分析Sub-G1期（凋亡导致基因组降解，其DNA含量少于G1期）细胞比例。

5.Bcl2家族基因表达水平的检测

常规提取细胞总RNA，采用荧光定量逆转录PCR检测，逆转录使用PrimeScript RT reagent Kit试剂盒（Takara，日本），引物序列见表1。荧光定量PCR反应体系按照预混SYBR试剂盒（Takara，日本）说明书配制，按荧光定量PCR仪（ABI 7500，美国）说明设置反应程序。实验所得数据按ΔΔCt法计算分析。

表1 引物序列

6.Wnt6蛋白表达水平的检测

采用蛋白印迹法法检测。BCA法检测蛋白浓度后，用12% SDS-PAGE胶电泳分离蛋白，电转至PVDF膜上，室温封闭1 h，先后用Wnt6抗体（ab50030，Abcam）或GAPDH抗体（#2118，Cell Signaling Technology）、过氧化辣根偶联的羊抗兔抗体（#7074，Cell Signaling Technology）孵育，于暗房内等体积混匀增强型化学生物发光试剂盒（WBKLS0500，Millipore）工作液，滴于膜上目的蛋白条带处，发光后曝光于X线胶片上。X线胶片在激光光密度图像扫描仪（CanoScan LiDE 25）上扫描后用ImageJ1.44软件计算条带灰度值，以内参GAPDH校正上样量计算蛋白相对表达量。

三、统计学处理

每项实验中，各浓度组均进行3次独立重复实验，采用SPSS17.0软件分析数据。使用回归分析拟合浓度-抑制率曲线计算IC50。计量资料以¯x±s表示，多组比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用Bonferroni法。多组比较以P＜0.05为差异有统计学意义，两两比较以P＜0.01为差异有统计学意义。

结 果

一、ApoG2对BGC823细胞的生长抑制作用

MTT实验结果显示，各浓度ApoG2均能明显抑制细胞生长，且随着ApoG2干预浓度升高和干预时间延长，抑制作用更加明显。给药24、48、72 h的IC50分别为2.11、1.22、0.59μmol/L，见图1。

图1 不同浓度ApoG2对人胃癌细胞系BGC823的生长抑制作用

二、ApoG2诱导BGC823凋亡的检测结果

1.形态学变化

ApoG2处理细胞48 h后，经Hoechst33258染色后可见典型凋亡细胞，细胞呈高亮蓝色，核固缩或呈分叶状，而对照组细胞呈淡蓝色。随ApoG2给药浓度升高，细胞数目逐渐减少，高亮细胞比例逐渐升高，见图2。

图2 不同浓度ApoG2作用下BGC823细胞的凋亡情况（Hoechst染色，×40）

2.细胞周期变化

与对照组相比，ApoG2处理细胞48 h后Sub-G1期细胞数目明显增多，1.25、2.5、5μmol/LApoG2处理细胞48 h后Sub-G1期细胞比例分别为（27.6±3.2）% 、（33.4±2.1）% 、（54.3±2.8）%，对照组Sub-G1期细胞比例为 （6.4±1.3）%，4组Sub-G1期细胞比例比较差异有统计学意义（F=192.6，P＜0.001），各给药组Sub-G1期细胞比例均比对照组明显增高（t分别为10.631、18.935、26.875，P 均 ＜0.001），且ApoG2 5μmol/L组中Sub-G1期细胞比例高于ApoG2 1.25μmol/L组及2.5μmol/L组，见图3。

三、ApoG2对BGC823细胞Bcl2家族基因表达的影响

BGC823细胞与0.1% 二甲亚砜、1.25、2.5、5μmol/L ApoG2分别孵育48 h后，1.25、2.5、5 μmol/L组Bcl2 mRNA表达水平分别比对照组下调至0.81、0.67、0.42倍（t=11.162，P＜0.01）。2.5、5μmol/L组Bax mRNA表达水平分别比对照组上调至1.95倍（t=16.454，P＜0.01）、6.24倍（t=90.76，P＜0.001），Bak mRNA表达水平则分别上 调 至 2.11、6.23 倍（t分 别 为 19.226、11.323，P均＜0.01）；1.25μmol/L组Bax、Bak mRNA表达水平分别为对照组的0.91、0.96倍，两组比较差异无统计学意义（P均＞0.05），见图4。

图3 不同浓度ApoG2作用下BGC823细胞周期检测结果

图4 不同浓度ApoG2作用下BGC823细胞Bcl2家族基因表达水平的比较

四、ApoG2对BGC823细胞Wnt6蛋白表达水平的影响

BGC823细胞与0.1%二甲亚砜、1.25和2.5 μmol/LApoG2分别孵育48 h后，1.25和2.5μmol/L组Wnt6蛋白表达水平分别比对照组下调至0.76、0.71倍（t分别为19.226、11.323，P均＜0.01），见图5。提取细胞总蛋白后，5μmol/L组在最大上样体积内无法满足最低上样蛋白量，降低蛋白量则影响对Wnt6表达的检测，故未检测5 μmol/L组ApoG2处理后细胞Wnt6蛋白的表达量。

图5 不同浓度ApoG2作用下BGC823细胞中Wnt6蛋白表达水平的比较

讨 论

我国胃癌发生率及病死率均较高，外科手术是治疗胃癌最有效的手段，然而多数胃癌发现时已错过了最佳手术时期，对于不能手术、术后复发或远处转移的胃癌，化学治疗是主要的治疗手段。胃癌对传统的化学治疗方法存在严重的耐药现象，因此寻找安全、有效的抗肿瘤药物是胃癌研究领域的重要任务。Bcl2蛋白家族与肿瘤的发生发展以及肿瘤耐药性的产生密切相关[11］。多种恶性肿瘤中可见Bcl2过度表达，在胃癌组织中Bcl2过度表达率高达60%～70%[12-13］。因此抑制肿瘤细胞过度表达Bcl2的抗凋亡作用可作为治疗胃癌的新策略。

ApoG2是具有Bcl2蛋白家族抗凋亡蛋白泛抑制作用的新型棉酚衍生物，与母体化合物相比具有更强的抗肿瘤作用和较小的毒性作用[14］。已有研究显示ApoG2可在体外诱导包括胃癌细胞系MKN28、MKN45和AGS凋亡[15］。胃癌动物试验也证实了ApoG2的体内抗肿瘤能力[3］。ApoG2可能成为治疗胃癌的新型药物之一，具有进一步研究的价值。本研究以取自中国患者胃癌组织建立的BGC823细胞株为模型，证实了ApoG2能够以低浓度抑制BGC823细胞生长，诱导细胞凋亡。据报道，Wnt6在胃癌细胞中高度表达，且表达量与胃癌细胞对化学治疗的耐药对象呈正相关，敲除Wnt6基因可明显提高胃癌细胞对化学治疗的敏感性[2］。在经典的WNT信号通路中，WNT信号可通过β-链蛋白调控核内基因转录，也有研究表明在结肠癌细胞中WNT信号可激活Bcl2抗凋亡蛋白Bcl-w启动子促进Bcl-w的表达抵抗细胞凋亡[16］。因此，研究进一步检测了ApoG2对Wnt6及Bcl2家族的影响。结果发现，ApoG2能够下调Wnt6蛋白的表达，同时下调抗凋亡标志Bcl2基因的表达水平，并上调促凋亡标志Bax和Bak的表达水平。本研究结果提示，ApoG2可能通过下调Wnt6的蛋白水平影响Bcl2、Bax和Bak的基因转录，引起细胞凋亡。由于Wnt6与胃癌耐药性密切相关，对于Wnt6高表达的耐药性胃癌，ApoG2有可能成为其中一种新型治疗药物。

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