艾滋病并发马尔尼菲青霉败血症1例

黄芩 李东明 孙婷婷 尚盼盼 葛杰 付又刚

(北京大学第三医院皮肤科，北京 100191)

马尔尼菲青霉病 (penicilliosis marneffei，PSM)是发生于艾滋病患者的机会性真菌感染，主要流行于东南亚及我国南部地区，多以发热、贫血、体重下降、淋巴结及肝脾肿大等非特异性症状就诊，非流行地区患者易被漏诊或误诊。PSM常出现的皮肤症状包括软疣样损害、丘疹、结节、皮肤坏死等［1］。晚期无皮肤症状者较少见。笔者诊断了1例无皮肤损害的PSM，患者表现为发热、淋巴结肿大、白细胞减少等症状，以血液及骨髓涂片中发现真菌孢子为线索，经培养确诊为真菌血症及艾滋病。形态学及DNA鉴定为马尔尼菲青霉病。现报道如下。

1 资料和方法

1.1 临床资料

患者男性，39岁，建筑工人，未婚，四川人，在广东工作10余年，因“发热、淋巴结肿大1个月”于2012年10月就诊。患者1个月前无明显诱因出现发热，伴轻度咳嗽，无痰。表现为稽留热，不伴寒颤，体温最高40℃，在当地医院以“上呼吸道感染”予抗生素(具体不详)治疗后咳嗽消失，体温曾降至正常。数日后上述症状加重，表现为持续高热，伴恶心、呕吐、轻度腹泻等消化道症状，并渐出现多发浅表淋巴结肿大。患者曾就诊于多家医院，检查发现白细胞、红细胞及血小板进行性减少，因骨髓涂片见可疑真菌孢子转入我科。患者既往体健，有冶游史。发病以来体重减轻约2 kg。

体格检查:体温40℃，呼吸21次/min，脉搏90次/min，血压110/70 mmHg。急性病容，神志清楚。双侧腹股沟可及多个绿豆至蚕豆大肿大淋巴结，质韧，境界清楚，活动度可，无压痛，余淋巴结未触及肿大。腹软，无压痛及反跳痛，肝肋下未触及，脾肋下约2 cm。专科查体未见皮疹。辅助检查:B超:肝区未见明显异常，脾脏稍大，双侧腹股沟多发肿大淋巴结。血常规:白细胞1.76×109/L，中性粒细胞百分比89.8%，淋巴细胞百分比4.5%，红细胞2.88 ×1012/L，血红蛋白 96 g/L，血小板 43 ×109/L;尿常规:潜血2+，尿蛋白2+;红细胞沉降率43 mm/h;C反应蛋白:9.26 mg/dl;肝功能:ALT 57 IU/L，AST 132 IU/L，γ-GT 306 IU/L，白蛋白 27 g/L;肾功能:BUN 21.2 mmol/L，Cr 192 mmol/L;血钾:4.87 mmol/L;免疫球蛋白:IgG 16.4 g/L，IgA 6.76 g/L，IgE 1 078 IU/mL;凝血功能:PT 15.3 s，INR 1.33，Fib 1.61 g/L，D-dimer 0.56 μg/mL;血利士曼原虫抗体阴性，疟原虫阴性;抗ENA、ANA、ds-DNA及ANCA相关抗体阴性。抗HIV抗体初筛及确认试验阳性。

1.2 骨髓涂片检查

进行骨髓穿刺并行骨髓涂片检查(瑞氏染色)。

1.3 血液培养瓶培养

取患者外周血行需氧及厌氧血培养。

1.4 真菌学检查及菌种鉴定

将患者外周静脉血标本分别无菌接种于沙氏培养基(SDA)和脑心浸液培养基 (BHI)27℃培养，48 h后挑取菌落转种马铃薯葡萄糖培养基(PDA)27℃培养5 d，并行小培养观察显微镜下结构。

1.5 DNA提取、PCR扩增及测序

DNA提取 采用CTAB法提取总基因组DNA。选取营养菌丝置于灭菌的1.5 mL Eppendorf管中，磨碎后，向 Eppendorf管加入 600 μL已在65℃预热的CTAB提取液，混匀后置入65℃的水浴中保温1 h。向Eppendorf管加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，12 000 r/min转速离心10 min。吸取上清液转至新的1.5 mL Eppendorf管，加入等体积氯仿/异戊醇，混匀，12 000 r/min转速离心10 min。吸取上清转至新的1.5 mL Eppendorf管，加入4/5体积的异丙醇，混匀后置于-20℃沉淀30 min，4℃下12 000 r/min转速离心10 min，弃上清，加入500 μL 70%乙醇，清洗DNA沉淀。室温干燥10 min，加入40 μL TE缓冲液，溶解DNA。

PCR反应 使用真菌通用引物 ITS4:5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ＇，ITS5:5 ＇-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3＇。PCR 反应条件:95℃ 预变性 5 min，95℃ 变性 30 s，50℃ 退火 30 s，72℃ 延伸45 s，共35个循环，72℃ 8 min，4℃保存。反应结束后1%琼脂糖凝胶电泳观察结果。

DNA测序 将PCR产物送北京华大基因公司进行碱基序列测定。

2 结 果

2.1 骨髓涂片检查

可见厚壁分隔真菌孢子(瑞氏染色)(见图1)。

2.2 血液培养瓶培养

培养结果为真菌生长。

2.3 真菌学检查

患者外周静脉血标本分别无菌接种于沙氏培养基(SDA)和脑心浸液培养基 (BHI)27℃培养，48 h后可见SDA培养基上有细小丝状真菌菌落生长。挑取菌落转种马铃薯葡萄糖培养基 (PDA)27℃培养5 d，可见菌种表面呈黄色粉末状，该菌产生大量红色色素将培养基染成深红色 (见图2)，显微镜下可见典型的帚状枝 (见图3)。脑心浸液培养基(BHI)37℃培养1周，菌落呈酵母样。初步鉴定为马尔尼菲青霉，菌株代号为PUTH12102702(Peking University Third Hospital)。

2.4 PCR扩增及测序鉴定

PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检查得到预期的1条约501 bp的DNA片段 (见图4)。对PCR产物直接测序并进行ITS区序列比对，鉴定为Penicillium marneffei，与标准株CBS 101038(1例来自印度的艾滋病患者)及ATCC201699(1例来自泰国的患者)的一致性为100%。

图1 骨髓涂片可见巨噬细胞内圆形和卵圆形有明显分隔的孢子(瑞氏染色，×100) 图2 菌种表面呈黄色粉末状，产生大量酒红色色素(27℃) 图3 小培养可见典型帚状枝(乳酸酚棉兰染色，×100) 图4 PCR扩增结果:所用引物分别为ITS4及ITS5，扩增片段大小为501 bp(C1、C2 样本提取自培养物菌悬液;D2000 从下到上依次为100 bp，250 bp，500 bp，700 bp，1 000 bp，2 500 bp;Marker从下到上依次为100 bp，200 bp，300 bp，400 bp，500 bp，600 bp)Fig.1 Bone marrow biopsy showed intracellular septate spores in macrophagocyte(Wright＇s staining，× 100)Fig.2 The colonies surface was powdery and yellow-green，revealed red diffusible pigment on PDA(27℃)Fig.3 Typical broom-shaped under microscope(Lactophenol Medan staining，×100)Fig.4 PCR proliferation primers:ITS4 and ITS5;product:a 501 bp sequence(C1，C2:samples from fungi culture suspension;D2000:100 bp，250 bp，500 bp，700 bp，1 000 bp，2 500 bp，respectively;Marker1:100 bp，200 bp，300 bp，400 bp，500 bp，600 bp，respectively)

2.5 诊断和转归

本例诊断为艾滋病合并马尔尼菲青霉败血症。给予氟康唑150 mg口服，1次/d。用药2次后再次行血培养，结果仍为阳性。患者转入传染病医院治疗数日后因病情迅速恶化死亡。

3 讨 论

马尔尼菲青霉病为马尔尼菲青霉(Penicillium marneffei，PM)感染引起的系统性真菌病，1988年Piehl等首次报道该病为HIV的合并症之一［2］。我国部分地区AIDS患者中PM感染率达12.3%，而播散型 PM感染者 HIV阳性超过70%，这是诊断 AIDS的重要线索和标志之一［3］。本例患者为青年男性，长期在广东地区工作，有冶游史，抗HIV抗体初筛及确认试验阳性，有系统性机会致病菌感染的临床表现及实验室依据，艾滋病合并马尔尼菲青霉败血症诊断成立。骨髓及血液涂片在诊断该病中起了重要作用。怀疑PSM时应尽快做HIV检测，并积极追踪，以防漏诊。

PM可致多系统感染，真菌败血症为其经血播散的主要途径。PSM临床分局限型及播散型两种，AIDS患者多为播散型感染。临床表现非特异，包括发热 (99%)、贫血 (78%)、严重体重下降(76%)、皮疹 (75%)、广泛淋巴结肿大 (58%)及肝脾肿大 (51%)等［4］。本例患者症状主要为发热、广泛淋巴结及脾脏肿大，伴有体重下降，且未出现皮疹，临床表现非特异。尽管PSM患者骨髓和淋巴结真菌培养阳性率几乎为100%，血液培养可达76%［5］，首先经血液诊断的病例仍较少，而经血液培养确诊的患者多已至发病晚期，很少能够接受及时的抗真菌治疗［6］。

PM为胞内寄生菌，感染人体后均寄生在单核-吞噬细胞内，被PM激活的CD4+T细胞可合成和释放多种细胞因子，吸引巨噬细胞聚集并活化，而在CD4+T细胞减少的个体中，巨噬细胞不但不能及时吞噬和杀灭PM孢子，反而成为其良好的避风港和繁殖地，形成播散性感染，引发PSM［7］。虽然PSM感染途径尚不清楚，但作为艾滋病的并发症，应与性接触或血液感染有关。本例中血液细胞中大量的真菌孢子表明该病具有极强的传染性，对于这种无其他器质性损害的患者及时作出诊断，无论对于阻止其艾滋病毒的传播，还是PSM的传播都具有十分重要的意义。

［1］Yang YS，Chang FY，N.C.Wang.A rare skin presentation ofPenicillium marneffeiinfection in an AIDS patient［J］.International journal of STD ＆ AIDS，2012，23(1):64-65.

［2］Piehl MR，Kaplan RL，Haber MH.Disseminated penicilliosis in a patient with acquired immunodeficiency syndrome［J］.Archives of Pathology＆ Laboratory Medicine，1988，112(12):1262-1264.

［3］赵国庆，冉玉平，向耕.中国大陆马尔尼菲青霉病的临床表现及流行病学特征的系统评价［J］.中国真菌学杂志，2007，2(2):68-71.

［4］赵建荣，樊移山，董庭荣，等.AIDS合并马尔尼菲青霉病36例分析［J］.中国真菌学杂志，2010，5(3):158-164.

［5］Supparatpinyo K，Khamwam C，Baosoung V，et al.DisseminatedPenicillium marneffeiinfection in southeast Asia［J］.Lancet，1994，344(8915):110-113.

［6］Chong，Y.B.，Tan LP，Robinson S，et al.Penicilliosis in lupus patients presenting with unresolved fever:a report of 2 cases and literature review［J］.Tropical biomedicine，2012，29(2):270-276.

［7］成先桂.马尔尼菲青霉与马尔尼菲青霉病［J］.中国真菌学杂志，2008，3(2):112-115.