医院制剂血尿康胶囊质量标准提升研究

1.贵州省遵义市第四人民医院,贵州 遵义 563004;2.贵阳中医学院,贵州 贵阳 550002;3.贵州省遵义市第三人民医院,贵州 遵义 563000

医院制剂血尿康胶囊质量标准提升研究

杨小翠1李江2*黄诗娅2王孝东3

1.贵州省遵义市第四人民医院,贵州 遵义 563004;2.贵阳中医学院,贵州 贵阳 550002;3.贵州省遵义市第三人民医院,贵州 遵义 563000

目的建立血尿康胶囊的质量标准，为医院制剂申报奠定基础。方法采用薄层色谱法(TLC)对血尿康胶囊中女贞子、墨旱莲、三七和焦栀子药材进行定性鉴别；采用高效液相色谱法(HPLC)测定血尿康胶囊中三七皂苷R1，人参皂苷Rg1，人参皂苷Rb1的含量。结果TLC定性鉴别斑点清晰，分离度好，色谱特征明显；HPLC测定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1分别在0.01～0.12μg、0.15～1.8μg、0.04～0.48μg范围内呈良好的线性关系，r值分别为0.9993、0.9991、0.9991，平均加样回收率分别为96.74%、97.29%、97.52%，RSD分别为0.74%、1.79%、1.56%。结论方法简便、可靠、专属性强、重复性好、方法准确，可用于血尿康胶囊的质量控制。

血尿康胶囊；薄层色谱法；高效液相色谱法；质量标准

血尿康胶囊的处方来源于中医内科副主任医师杨小翠结合临床所运用的滋肾化瘀清利汤(血尿康汤)，是贵州省遵义市第三人民医院院内制剂，由女贞子、墨旱莲、焦栀子、女贞子、三七粉、白花蛇舌草等十二味药组成。其主要功效为滋阴化瘀，清热止血，用于肾阴亏虚所致的肾性血尿症。临床上疗效确切，需求量大。原血尿康汤方没有固定的质量标准，很难对药品质量进行控制，课题组拟将此方研究开发为治疗肾阴亏虚所致的肾性血尿症的胶囊剂，按照SFDA关于医疗机构制剂的技术要求，完成血尿康胶囊处方研究、制剂工艺、质量标准、稳定性及临床研究，并申请医院制剂生产批件。本文主要报道质量标准研究部分，通过建立该胶囊中的墨旱莲、焦栀子、三七、女贞子药材的薄层鉴别方法，并采用HPLC测定血尿康胶囊中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的含量，最终建立血尿康胶囊的质量标准，保证临床用药的安全、有效和稳定。

1 仪器与试药

1.1 仪器 日立(HITACHI)高效液相色谱仪，安灵ZF-2型三用紫外仪(上海市安亭电子仪器厂)，电子天平(Sartorius德国赛多利斯),恒温水浴锅(江苏国胜实验仪器厂)；科导SK8210HP型台式超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)。

1.2 试药 血尿康胶囊及阴性样品由贵州省遵义市中医院药剂科提供；齐墩果酸对照品(110709-200304，中国药品生物制品检定所)；栀子苷对照品(110749-201115，中国食品药品鉴定研究院)；墨旱莲对照药材(120958-201106，中国食品药品鉴定研究院)；人参皂苷Rb1(110704-200420)、人参皂苷Rg1(110703-200726)和三七皂苷R1(110745-200617)均购至中国药品生物制品检定所。硅胶G预制板(青岛海洋化工厂生产)；甲醇：色谱纯。其余所用试剂均为分析纯。

2 定性鉴别

2.1 女贞子的鉴别 取血尿康胶囊内容物10g，加三氯甲烷30ml，超声处理30min，滤过，滤液挥干，残渣加1ml甲醇使溶解，作为供试品溶液。另取齐墩果酸对照品适量，制成每1ml含1mg的溶液。作为对照品溶液。再取缺女贞子药材v的血尿康胶囊内容物10g，按供试品溶液制备的方法制成阴性对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷—甲醇(8:1)作为展开剂[1-3]，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在106℃下加热至斑点显色清晰。分别置于日光灯下观察，供试品色谱中，在与对照品溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照溶液色谱无斑点(见图1)。

1～3.供试品 4.齐墩果酸对照品 5.缺女贞子药材阴性对照品

2.2 墨旱莲的鉴别 取血尿康胶囊内容物4.0g，加水50ml，加热使溶解，用醋酸乙酯提取3次，每次30ml，合并醋酸乙酯液，用蒸馏水洗涤2次，每次10ml，合并乙酸乙酯液水浴挥干，残渣加醋酸乙酯1ml，使溶解，作为供试品溶液。另取墨旱莲对照药材0.5g和缺墨旱莲药材的血尿康胶囊内容物4.0g，按供试品溶液制备的方法分别制成墨旱莲对照药材溶液和阴性对照品溶液，照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液、阴性对照品溶液10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(30℃～60℃)—甲酸乙酯—甲酸(15∶5∶0.9)的为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯光灯(365nm)下检视[4-6]。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。阴性对照溶液色谱无斑点(见图2)

1～3.供试品 4～5.墨旱莲对照药材 6.缺墨旱莲阴性对照品

2.3 三七的鉴别 取胶囊内容物2g，加石油醚(60℃～90℃)20ml，置于水浴上加热回流30min，弃去石油醚，药渣挥干，加甲醇20ml，置水浴上加热回流2h，过滤，滤液挥干，残渣加水5ml溶解，用水饱和正丁醇提取2次，每次10ml，合并正丁醇液，用水洗涤2次，每次10ml，分取正丁醇液置于水浴上挥干，残渣加甲醇2ml溶解，即可。分别精密称取人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1适量，分别加甲醇制成人参皂苷Rb1对照品溶液(1mg/ml)、人参皂苷Rg1对照品溶液(1mg/ml)、三七皂苷R1对照品溶液(1mg/ml)。另取缺三七的血尿康胶囊内容物2g，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷—乙酸乙酯—甲醇—水(15∶40∶25∶10)10℃下放置的下层液作为展开剂[7-10]，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃下加热至半点显色清晰。分别置于日光灯与紫外光灯下观察，供试品色谱中，在与对照品溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照溶液色谱无斑点(见图3、图4)。

1～3.供试品 4.人参皂苷Rg1对照品 5.人参皂苷Rb1对照品 6.三七皂苷R1对照品 7.缺三七药材阴性对照品

1～3.供试品 4.人参皂苷Rg1对照品 5.人参皂苷Rb1对照品 6.三七皂苷R1对照品 7.缺三七药材阴性对照品

2.4 焦栀子的薄层色谱鉴别 取胶囊内容为5g，加甲醇20ml，超声处理30min，滤过，滤液挥干，用5ml甲醇溶解，作为供试品溶液。另取栀子苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液。再取缺栀子的血尿康胶囊内容物5g，按供试品溶液制备的方法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿—甲醇—氨水(5∶1∶0.1)为展开剂[11-14]，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在110℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视。供试品色谱中，在与对照品溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照溶液色谱无斑点。(见图5)

1～3.供试品 4～5.栀子苷对照品 6.缺栀子阴性对照品

3 三七总皂苷的含量测定

3.1 色谱条件与系统适用性 GeminiC18色谱柱(250×4.60mm，5μm)，流动相乙腈-水，梯度洗脱[15-21](0→14min,18%→22%乙腈，14→70min，22%→38%乙腈)；流速0.6ml·min-1；检测波长203nm；柱温：37℃；进样量20μl。该条件下，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1与邻峰分离完全(分离度>1.5)，理论塔板数以三七皂苷R1峰计算不低于4000。阴性空白色谱图在三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1位置处无干扰峰(见图6)。

图6-1 (对照品溶液)

图6-2 (供试品溶液)

图6-3 (阴性对照溶液)

3.2 对照品溶液的制备 精密称取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1对照品适量，加甲醇制成每1ml含三七皂苷R1 0.01mg、人参皂苷Rg1 0.15mg和人参皂苷Rb1 0.04mg的混合溶液，备用。

3.3 供试品溶液的制备 精密称取血尿康胶囊内容物0.5g，置于具塞锥形瓶中，精密加入50ml甲醇，称精密称重，回流2h，再次称重，用甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液过0.45μm滤膜即可。

3.4 阴性对照溶液的制备 按处方中药味比例，称取除三七以外的其它药材，同血尿康胶囊制备方法制成三七阴性对照溶液，取相当于供试品的量，再按“3.3”项方法制成阴性对照溶液。

3.5 线性关系考察 精密吸取上述对照品溶液1,3,5,7,10,12μl，分别注入高效液相色谱仪，按以上色谱条件测定，分别以三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的实际进样量(μg)X为横坐标，以峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线并进行线性回归，计算3种皂苷的回归方程，结果提示3种皂苷的线性关系良好。三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的回归方程分别为Y=11624X-10568、Y=76884X-60059、Y=35586X-24828，r值分别为0.9993、0.9991、0.9991，线性范围分别为0.01～0.12μg，0.15～1.8μg，0.04～0.48μg。

3.6 精密度试验 精密吸取同一浓度混合对照品溶液20μl，连续测定6次，测定3种皂苷的峰面积，结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1峰面积的RSD值分别为：1.14%、1.49%和1.69%，提示仪器精密度良好。

3.7 稳定性实验 取样品一份，精密称定，照拟定的供试品制备方法制备样品，分别于0、2、4、6、8小时进样10μl，测定3种皂苷的峰面积，结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1峰面积的RSD值分别为：1.25%、1.20%和1.73%，提示供试品溶液在8h内稳定。

3.8 重现性试验 取同一批号(20130511)血尿康胶囊，按“3.1.3”项下方法制备 6 份供试品溶液，分别进样测定，结果样品中三七皂苷 R1、人参皂苷 Rg1和人参皂苷 Rb1含量平均值(n=6)分别为1.16mg/g，16.16mg/g，4.01mg/g。RSD值分别为1.09%，1.86%，1.48%。表明此法重现性良好。

3.9 加样回收率试验 取同一批血尿康胶囊内容物各6份，精密称定，分别加入三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1对照品溶液适量(配成溶液加入)，按拟定的含量测定方法，测定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1含量，计算回收率。三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1平均回收率分别为96.45%、96.57%、96.95%，相对标准偏差(RSD)分别为1.02%、0.68%、1.71%结果见表1。

3.10 样品含量测定 取血尿康胶囊不同批号样品，按供试品制备方法处理后测定，计算每粒胶囊中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的含量，结果见表2。

表1 加样回收率试验结果

表2 样品含量测定结果

4 讨论

女贞子、墨旱莲为方中君药，二者合用共奏滋阴补肾，清热凉血之功，墨旱莲的鉴别首先采用旱莲苷A、墨旱莲对照药材为对照品，但由于旱莲苷A在该条件下不显色，而墨旱莲对照药材有相应的斑点，故决定采用墨旱莲对照药材作为对照。在上述展开条件下样品能更很好的分离，且阴性对照无干扰。女贞子鉴别中供试品溶液制备的取样量分别考察了2g、4g、5g、10g、15g，其中10g与15g的取样量所展开的结果相近，相比2g、4g、5g的展开结果好，故取样量定为10g。焦栀子、三七的薄层鉴别研究中，薄层斑点分离良好，结果均能检出相应色谱斑点，表明方法具有专属性和重现性，可作为血尿康胶囊制剂质量控制定性检测指标。由于女贞子中专属性成分含量轻微，缺乏定量依据，而方中三七为制剂中的臣药，在本方中主要奏化瘀止血、补虚增强之功，且三七为贵重药材，其总皂苷具有活血化瘀、补血活血的作用，三七中三七皂苷 R1、人参皂苷 Rg1和人参皂苷 Rb1又是药典规定要检测的成分，所以对以上 3 种成分进行含量测定，能更有效地控制本品质量。

本研究采用高效液相色谱方法测定三七皂苷R1、人参皂苷 Rg1和人参皂苷 Rb1的含量，并分别对精密度、稳定性、重现性和回收率进行了考察。实验结果表明所建立的方法稳定、准确、可靠，可作为血尿康胶囊中三七皂 R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷 Rb1的含量的测定方法。

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ResearchtoimprovethequalitystandardofhospitalpreparationsXueniaokangcapsule

YANG Xiao-cui1,LI Jiang2,HUANG Shi-ya2,WANG Xiao-dong3

The Fourth People′s Hospital of Zunyi city Guizhou Province,Zunyi 563004,China;Guiyang College of Traditional Chinese Medicine,Guiyang 550002,China;The third People′s Hospital of Zunyi city， Guizhou Province,Zunyi 563000,China

ObjectiveTo establish a method for the quality control of Xueniaokang capsule,laying the foundation for the application of hospital preparations.MethodLigustrum lucidum, Eclipta prostrate, Panax-notoginseng, Gardenia jasminoides were identified by thin-layer chromatography(TLC).The notoginsenoside R1 and notoginsenoside Rg1/Rb1 of Xueniaokang capsule was determined by HPLC.ResultThe characteristic for identification by TLC was distinct. The linear correlation of notoginsenoside R1 and notoginsenoside Rg1/Rb1 was good in the range of 0.01～0.12μg(r=0.9993), 0.15～1.8μg(r=0.9991), 0.04～0.48μg(r=0.9991), respectively. The range of the spotting recovery rate was 96.74%(RSD=0.74%), 97.29%(RSD=1.79%) and 97.52%(RSD=1.56%), respectively.ConclusionThe method is convenient and reliable with good specificity and reproducibility．It can be used for the quality control of Xueniaokang capsule．s

Xueniaokang capsule; TLC; HPLC; quality specification

此研究为贵州省科技厅2012年省市科技合作专项资金项目，课题编号：省市科合(2012)50号。

杨小翠(1971-),女,遵义市第四人民医院副主任医师,长期从事糖尿病、肾脏病的中西医结合诊治与临床研究工作。E-mail:303630441@qq.com

李江(1973-)，现任贵阳中医学院教授，博士学位，主要研究方向：中医方剂配伍研究和民族药系统研究与开发。E-mail:13984044866@139.com

R284.1

A

1007-8517(2014)14-0018-04

2014.05.25)