纤维素生物质生产燃料乙醇的研究进展

曹月乔，张国良,2*，王菲菲

(1．淮阴工学院 生命科学与化学工程学院，江苏 淮安 223003；2．江苏省生物质能与酶技术重点实验室，江苏 淮安 223003)

0 引言

近年来，随着全球经济增长，原油消耗大幅增加，价格持续走高，能源供应及安全问题已成为世界各国需要面对的主要问题之一。化石能源在生产和使用的过程中排放出大量的二氧化碳和二氧化硫，造成全球变暖。随着我国经济的快速发展，对石油进口的依赖程度不断加大，开发新能源和可替代能源，并提高其在能源结构中的比例已经迫在眉睫。近十多年来，作为替代能源之一的生物燃料乙醇(根据可发酵糖获得来源，可将燃料乙醇分为：第一代常规生物燃料——“糖-淀粉”乙醇；第二代纤维素乙醇)在世界和我国已相继开展研究并进行产业化，特别是以甘蔗、玉米等糖类作物为原料的第一代燃料乙醇产业已形成规模，在世界燃料乙醇供应中起到举足轻重的作用。2011 年，世界燃料乙醇生产大国——美国和巴西的几乎全部燃料乙醇皆以玉米淀粉及甘蔗中的可发酵糖为原料生产而来，两者乙醇产量之和为5900 万吨，占世界总产量6700 万吨的88%。

由于第一代生物燃料乙醇存在与人争粮、与粮争地以及成本高等问题，严重制约着产业的可持续发展[1]，不适合我国国情，也不适宜在全国推广。而纤维素生物质是地球上最丰富的可再生资源，地球上每年经光合作用固定在绿色植物的总碳就达2×1011吨，其中绝大部分是构成植物支撑组织的木质纤维。我国作为一个农业大国，生物质资源丰富，仅每年产生的秸秆就多达7亿多吨，大力发展以农作物秸秆、木屑、废纸等纤维素生物质(主要成分为纤维素、半纤维素和木质素[2])为原料的第二代纤维素乙醇被认为是最有发展前途的非粮生物燃料之一，是木质纤维素类生物质工业转化的一个重要方向，具有广阔的发展前景。我国对纤维素乙醇的发展也很支持，政府将采取措施力保实现《可再生能源中长期发展规划》中的任务——到2020年实现生物燃料乙醇年利用量达1000万吨。发展纤维素乙醇对于解决当前石油资源短缺、增加农民收入以及减少环境污染等方面具有十分重要的意义。

利用木质纤维素转化为燃料乙醇的主要生产工艺包括原料预处理、纤维素水解、五碳糖与六碳糖发酵、乙醇分离等。本文对纤维素水解及燃料乙醇发酵工艺的研究进展进行了总结，并对其产业化发展进行了展望。

1 分步水解发酵(SHF)

SHF工艺是纤维素酶法水解与糖发酵分步进行，即先用纤维素酶水解木质纤维素，再将酶解产生的糖液作为发酵碳源，纤维素的酶解和酶解液的发酵分别在不同的反应器中进行。其主要特点是水解与发酵分别都可在它们的最适条件下进行，酶解主要工作条件为50～60℃，pH3～5；发酵主要工作条件为30～40℃，pH6～8。

在纤维素酶解过程中，纤维二糖的积累会抑制内切和外切葡聚糖酶的活性，葡萄糖的积累对于β-葡萄糖苷酶的催化也有一定的抑制作用。随着水解过程中葡萄糖浓度的不断升高，酶解反应很快就因为产物抑制作用而使反应速度降低，反应进行不完全，这样导致酶解糖化效率不高，从而影响后续发酵的乙醇得率[3]。

可以通过补加β-葡萄糖苷酶，减少纤维二糖的积累从而降低对外切葡聚糖酶的抑制作用，或者将反应器内糖化生成的葡萄糖通过超滤膜分离出去，从而消除产物抑制，提高反应速度，但超滤膜的大规模应用带来成本的显著增加。

2 同步糖化发酵(SSF)

SSF 工艺是目前木质纤维素生物转化乙醇研究中运用最多的一种方法，是纤维素酶法水解与发酵同步进行。该工艺无需独立的纤维素水解反应器，减少了反应器的数量，并且在加入纤维素酶的同时接种乙醇发酵的酵母菌，可使生成的葡萄糖被酵母菌发酵成乙醇，解除了酶解产生的糖的反馈抑制作用，提高了酶解的效率。

该工艺中由于纤维素酶解条件和发酵条件不匹配，尤其是反应适宜温度的不匹配(酶解适宜温度50℃，发酵适宜温度30℃)，导致发酵周期长。为了使SSF 工艺的温度达到最佳的酶解温度，缩短发酵时间，可采用嗜热酵母和细菌作为乙醇发酵菌株，选择耐高温酵母菌有利于SSF 技术的应用。Krishna 等采用酿酒酵母同时进行糖化和发酵时的最佳温度为38.5℃，而美国国家可再生能源实验室(NREL)使用酿酒酵母菌发酵的最佳条件是38℃，在最佳的酶、酵母和最适反应条件下，可将80% 以上的纤维素转化为乙醇[4]。

在SSF工艺中，为兼顾酶解与发酵温度，SSF一般采用的温度为36～38℃，而且为了提高乙醇产率，常常对同步糖化发酵工艺条件进行优化。刘庆玉等以生物预处理后的玉米秸秆为原料，采用纤维素酶作为纤维素的糖化酶，采用酿酒酵母和树干毕赤酵母对葡萄糖和木聚糖等混合糖进行同步糖化发酵制取燃料乙醇[5]。以分光光度法测定发酵液中的乙醇含量，对发酵时间、发酵温度、接种比例、纤维素酶用量4个条件进行单因素试验分析，再通过正交试验对发酵条件进行优化。得到最适发酵参数分别为发酵温度36 ℃，发酵时间96 h，接种比例1∶1，纤维素酶用量40 IU/g，最后乙醇产率为12.03%。

3 同步糖化共发酵(SSCF)

SSCF工艺是从SSF工艺的基础上发展起来的[6]，与SSF工艺相比，该工艺是纤维素酶法水解与己糖和戊糖发酵同时进行，且是在同一个发酵罐中采用发酵菌种对己糖和戊糖进行发酵。使用该工艺不仅可以节省设备投资费用、有效缓解葡萄糖对纤维素酶的反馈抑制作用，而且还可以提高木质纤维素乙醇发酵液中的乙醇浓度。

Georgieva等将预处理过的小麦秸秆在pH5.0条件下发酵，发现不同浓度的秸秆经SSCF工艺发酵后葡萄糖的利用率均高于90%，且木糖转化率在72%～80%之间[7]。密歇根州立大学的Jin等以柳枝稷为原料，在pH5.5、35℃条件下加入4%的纤维素酶，采用两步法SSCF 技术得到最终木糖的浓度为11.2g/L，乙醇的浓度为32.1g/L，其中葡聚糖的转化率为80.3%，木聚糖的转化率为84.3%，说明该工艺有利于缓解葡萄糖对纤维素酶的反馈抑制作用[8]。

此外，Koskinen 等将分离到的命名为K17、K15 两株嗜热厌氧菌共发酵木质纤维素，能同时利用葡萄糖和木糖产生酒精和H2，菌株K17在酒精体积分数达到4%时仍没有明显抑制效应，有利于发酵液中乙醇的积累，提高木质纤维素乙醇发酵液中最终的乙醇浓度[9]。

该工艺中使用的菌种可以是混菌也可以是木糖代谢工程菌，木糖代谢工程菌一方面可以以有广泛底物利用特性的微生物(如大肠杆菌和产酸克雷伯氏菌)为基础，利用其本来就有的木糖、阿拉伯糖转化能力，通过基因工程技术改善其产物的选择性(例如导入转化丙酮酸为乙醇的途径，使其更多地生成乙醇，或阻断其副产物合成途径)及其它同合成产物相关的特性(如耐酒精及其它毒性抑制物的能力)；另一方面以已有很高产物选择性和其它产物合成特性的乙醇发酵菌株(如酿酒酵母和运动发酵单胞菌)为基础，通过代谢工程手段赋予乙醇发酵菌株利用戊糖(木糖或阿拉伯糖)发酵的能力。如NREL将木糖异构酶基因(xylA)、木酮糖激酶(xylB)、转酮醇酶基因(talB)及转酮醛酶基因(tktA)利用基因工程方法，成功导入运动发酵单胞菌(Zymomonasmobiles)，实现了混合糖发酵生产乙醇[10]。

4 非等温同步糖化发酵(NSSF)

该法生产乙醇的工艺流程很好地解决了纤维素酶糖化与酵母发酵2个过程中温度不匹配的矛盾，可节约纤维素酶30%～40%，同时乙醇的产量和产率均显著提高。

马晓轩等将黑曲霉和康宁木霉混合菌经过种子扩增后接入秸秆发酵培养基，在28℃、150r/min培养，在第140 h时再将培养液调至pH4.8，于55℃、150 r/min进行酶解5 h，测还原糖量。随后接入产朊假丝酵母，接种量10%，在28℃、100 r /min条件下发酵培养48h，测定乙醇产量。结果显示采用NSSF法的产糖量显著大于SSF的产糖量，且NSSF发酵的乙醇产量(0.14 g/g干秸秆)显著大于SSF发酵的乙醇产量[11]。原因是纤维素酶的最适反应温度为55℃，并且在一定程度上可以抑制降解微生物对糖的消耗，NSSF法产生了更多的还原糖，而SSF法并不经历此阶段。

Kang等利用耐高温酵母菌CHY1612进行该工艺时，温度由糖化时的45℃调节至发酵时的35℃，得到的纤维素乙醇产量为34.3 g/L，明显高于在45℃条件下进行SSF时的产量22.2 g/L[12]。此时葡萄糖转化率为89.3%，乙醇产率为90.6%。

5 直接微生物转化法(DMC)

直接微生物转化法又称联合生物加工工艺(CBP)，是把生物质制乙醇过程传统工艺各单元进行整合，即将纤维素酶的生产、酶解糖化和乙醇发酵三个单元耦合在一步同时进行[13]，该工艺要求微生物或微生物群既能产生纤维素酶，又能利用可发酵糖类生产乙醇。这样既简化了工艺，又降低了成本。自然界中的某些微生物如Clostridium、Moniliar、Fusarium、Neurospora等都具有直接把生物质转化为乙醇的能力。但到目前为止，研究的菌种耐乙醇浓度差，副产物多，乙醇浓度和得率低。

2009年，Mascoma 公司在纽约州Rome生产纤维素乙醇的装置上使用了该技术，利用酵母和细菌共同完成纤维素酶的生产和乙醇发酵过程，减少了酶生产单元，大大降低了生产费用。

6 间接生产乙醇技术

除上述直接通过发酵生产乙醇的方式，还有通过纤维素生物质间接生产乙醇的技术。美国ZeaChem公司将废木料利用酸水解得到葡萄糖和木糖，利用乙酸发酵菌将糖转化为乙酸，然后乙酸酯化生成乙酸乙酯，乙酸乙酯加氢生成乙醇，氢气由酸水解得到的木质素气化生产[14]。该技术的优点在于可以利用整个木质纤维素，提高了原料利用率，每吨干物质的乙醇产量可达160加仑，相比于其它工艺，乙醇产率提高了50%。

Phillips将生物质在隔绝氧气的状态下进行高温处理(600～1000℃)，得到混合裂解气(主要成分是CO、CO2、H2、CH4和N2)；然后混合气经过化学转化途径在金属催化剂作用下转化得到乙醇和C3以上的混合醇[15]。此外，还可以将混合气整合后进入发酵设备，通过细菌的作用转化成乙醇[16]。该技术能将全部供入物料都用于气化，产生极少的废弃物，同时用水极少，节约了成本。

7 展望

目前，发展纤维素燃料乙醇产业面临着生产成本居高不下的挑战，利用木质纤维素生产燃料乙醇需要满足以下三个基本技术要求：简洁高效的原料预处理技术、高效低成本的纤维素酶、戊糖与己糖共发酵生产乙醇。因此，应该主要从这三个方面着手以降低燃料乙醇的生产成本。

7.1 预处理技术

纤维素生物质的预处理是生产燃料乙醇的关键因素之一[17]。木质纤维素的结构十分复杂，细胞壁中的半纤维素和木质素通过共价键联结成网络结构，纤维素镶嵌其中，阻止酸或酶进入纤维素和半纤维的区域，使得纤维素难以被水解。通过纤维素生物质的预处理技术，改变天然纤维的结构，使纤维素、半纤维素和木质素得以分离，增加纤维素与酶的接触面积，可提高纤维素的水解效率。

目前常见的预处理方法主要有物理法(机械粉碎法[18]、高温处理法[19]、微波法[20])；化学法(酸水解法[21,22]、碱水解法[23]、有机溶剂法[24])；物理化学法(蒸汽爆破法[25]、氨纤维爆破法[26]、湿氧预处理法[27,28])；生物法[29]。

预处理过程中需要消耗大量的化学品或热能，增加了设备投资或污水处理成本。此外，预处理可能还会产生对发酵有抑制或毒性的酚、醛、酸等有机物[30]。因此，应重点发展原料转化率高、低耗能、低污染的纤维素预处理技术，增加酶与植物纤维接触的表面积[31]，并消除对微生物有危害的毒性物质，以利于生物降解、提高预处理效率，减少成本。

7.2 纤维素酶

纤维素酶是降解纤维素成为葡萄糖所需的一组酶的总称，一般认为其主要包括3个组分：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。纤维素酶的来源非常广泛，昆虫、微生物、细菌、放线菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶。目前应用于纤维素酶生产的主要是木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、镰孢菌属(Fusarium)等菌种。

纤维素水解生成葡萄糖的过程必须依靠纤维素酶的协同作用才能完成。酶水解工艺具有条件温和( pH为4.8，温度为45～55℃) 、能量消耗小、不生成有毒降解产物、糖转化率高、无腐蚀、无环境污染和无发酵抑制物等特点。但纤维素酶的生产成本占糖化总成本的60%，为整个生产成本的20%左右[32]。目前使用的纤维素酶的比活力较低，单位原料用酶量很大，酶解效率低。因此，应该积极开发高效生物酶，降低生产成本，优化酶水解工艺，从而降低生产纤维素燃料乙醇的成本。

近年来，世界上两个最大的产酶公司Genencor International 和Novozymes Biotech加大了对纤维素酶的研究力度，努力增加酶活并降低成本，以生产最高效的纤维素酶，如Cellic CTec2 酶[33]等；我国山东大学微生物技术国家重点实验室对纤维素酶高产菌的筛选和诱变育种以及用基因手段提高产酶量或改进酶系组成等进行了研究。其中，诱变育种是一个有效的途径，并且已经获得了纤维素酶活力显著提高的菌株，如斜卧青霉(P.decumbens)JUA10-1、JUA10-S、JUA10-T等。此外，通过基因组重排技术获得产酶能力较出发菌株提高了2 倍以上的GS2-15、GS2-21、GS2-22等[34-38]。

7.3 发酵微生物

在纤维素生物质酶解糖化过程中，有20%左右的半纤维素降解为戊糖，而自然界中高效的乙醇发酵菌株缺少利用和转化戊糖的能力或转化效率很低，这无疑降低了木质纤维素的乙醇转化率[39-41]。而理想的生物质乙醇发酵菌应该能够发酵所有生物质来源的糖，并与纤维素完全水解所需的纤维素酶有协同作用。因此，构建能够利用戊糖的工程菌就显得尤为重要。

目前，利用现代基因工程技术构建基因重组菌株，是获得代谢葡萄糖和木糖高效产乙醇重组菌株的一条重要途径。通过打断琥珀酸合成途径中的延胡索酸合成酶基因，产生的名为KO11 的大肠杆菌可发酵半纤维素水解产物中的几乎所有的糖生产乙醇，其乙醇生产能力较高，并且对木质纤维素水解产物中的抑制剂具有相对高的耐受性；此外，美国Purdue 大学将木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶的基因转入了糖化酵母(S.diastaticus)和葡萄汁酵母(S.uvarum)的融合菌株，该菌能同时发酵葡萄糖和木糖为酒精，提高了发酵酒度和底物利用率。

7.4 其他

制定原料供应保障制度，建立有效的纤维素生物质收集、储存及运输体系，解决制约纤维素乙醇产业发展的原料供应问题，确保纤维素燃料乙醇健康有序发展；完善燃料乙醇的补贴政策，建议国家根据燃料乙醇生产原料分别确定补贴，使对纤维素乙醇的补贴高于第一代燃料乙醇，提高社会对发展该产业的积极性；此外，建议国家在纤维素燃料乙醇的研发及产业化示范上提供财政支持，并出台相应扶持政策，整合国内研发力量，推动纤维素燃料乙醇产业化技术早日实现。

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