菠萝皮黄酮的提取及其稳定性、抗氧化性研究

王 芳 ，高瑜珑 ，石建雯

（1.浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华321004；2.浙江师范大学行知学院，浙江金华321004）

菠萝（Ananas comosus（L.）Merr.）又名凤梨，是四大热带水果之一。我国菠萝年产量140余万t，居世界第4位[1]。菠萝除了直接食用外，还可以加工成饮料、罐头、蜜饯、酒、色拉等食品，在食用和加工过程中产生的菠萝皮有50%～60%[2]被丢弃。据报道，菠萝皮含有的营养成分与果肉的基本成分相接近[3]，大量的丢弃既浪费资源，又污染环境。有研究表明，黄酮类化合物具有多种生物活性，如抗氧化[4-8]、抗癌[9-10]、调节免疫[11-12]、抗菌[6，13-14]、抗病毒[15-16]、抗炎症[4]、抗过敏、预防心血管病等[17-19]。

本试验对冬、夏季菠萝皮中黄酮类化合物的提取、稳定性及体外抗氧化活性进行研究，以期进一步开发利用菠萝皮，提高菠萝的附加值，拓宽黄酮类化合物的来源，同时减轻环境压力。

1 材料和方法

1.1 试验材料

夏、冬季菠萝分别于2013年7，12月购于金华水果市场，取菠萝皮于60℃烘干至恒质量，粉碎过0.42 mm筛，贮于避光、干燥、冷藏环境中。

1.2 试验试剂

芦丁、DPPH为分析纯，Sigma化学公司产品；其余试剂均为分析纯（碘化钾为优级纯）。

1.3 主要仪器和设备

HWS28型电热恒温水浴锅、DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）；T6新世纪紫外分光光度计（上海天美科学仪器有限公司）；JY1002电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；RE-52 AAB旋转蒸发器（温州奥利生物医学仪器厂）。

1.4 菠萝皮总黄酮含量的测定

1.4.1 标准溶液的制备 精密称取芦丁0.500 0 g，用70%乙醇配制成1.0 mg/mL的标准溶液，备用。

1.4.2 最大吸收波长的确定[20]精密吸取标准芦丁溶液 0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 mL，分别加蒸馏水至3.0 mL，加5%亚硝酸钠0.5 mL，混匀放置6min，加10%硝酸铝0.5mL，混匀放置6min，加5%NaOH 2.5 mL，混匀放置15 min，蒸馏水定容至10 mL，以不加标准芦丁溶液组作为空白，用T6新世纪紫外分光光度计在400～600 nm下进行扫描。测得在波长为490 nm处吸光值最大，因此，选择490 nm作为测定波长。

1.4.3 芦丁标准曲线的制作 分别精密吸取标准芦丁溶液 0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 mL，同1.4.2方法在490 nm处测吸光值，根据吸光值经最小二乘法作线性回归处理，得芦丁质量浓度C（mg/mL）和吸光值A的标准曲线回归方程为：C＝0.090 4A＋0.000 1，R2＝0.999 7。

1.4.4 黄酮含量的计算 取3 mL待测液于10 mL容量瓶中，同1.4.2方法在490 nm处测吸光值。样品中黄酮类化合物含量，其中，C为从标准曲线中查得的黄酮类化合物的质量浓度（mg/mL）；Vt为提取液总体积（mL）；Vs为测定时取样体积（mL）；W为样品质量（干质量，g）。

1.5 菠萝皮中黄酮类化合物的提取工艺研究

1.5.1 单因素试验 称取1.00 g菠萝皮样品粉末，分别考察不同的提取溶剂（0，20%，40%，60%，80%，95%乙醇）、料液比（1∶10，1∶30，1∶50，1∶70）、提取温度 （20，40，60，80 ℃） 和提取时间（0.5，1，2，3，4 h）对黄酮含量的影响。所有试验数据均重复3次。

1.5.2 正交试验 在单因素试验的基础上，每个因素选取3个适宜水平，运用L9（34）正交试验，确定提取冬、夏季菠萝皮黄酮的适宜条件。正交试验方案如表1，2所示。

表1 正交试验方案（冬季菠萝皮）

表2 正交试验方案（夏季菠萝皮）

1.6 菠萝皮中黄酮类化合物的稳定性研究

取所得黄酮类化合物配制成50μg/mL水溶液，分别考察光照（太阳直射、避光）、碳水化合物（淀粉、蔗糖、葡萄糖）、氧化剂和还原剂（H2O2、氧化亚铁、Vc）、金属离子（K+，Na+，Cu2+，Zn2+，Al3+，Mg2+，Ca2+，Fe3+）对其稳定性的影响。

1.7 菠萝皮中黄酮类化合物的抗氧化性研究[21]

取待测液2 mL及1×10-4mol/LDPPH 2 mL加入同一具塞试管中，混匀，30 min后用无水乙醇作参照，在517 nm处测定其吸光度Ai，同时测定2 mL 1×10-4mol/L DPPH溶液与2 mL无水乙醇混合液的吸光度Ac，以及2 mL待测液与2 mL无水乙醇混合液的吸光度Aj，根据下列公式计算待测液对DPPH的抑制率。

抑制率＝（1－（Ai－Aj）/Ac）×100%，其中，Ac为未加待测液时DPPH的吸光度；Aj为待测液的吸光度；Ai为加待测液后DPPH的吸光度。

2 结果与分析

2.1 菠萝皮中黄酮类化合物的提取工艺研究

2.1.1 单因素试验

2.1.1.1 提取溶剂的选择 目前，国内外溶剂法提取黄酮一般采用甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、乙酸乙酯等有机溶剂[22]。相对其他溶剂来说，乙醇具有浸提效率高、毒性小、价格低廉且黏度小，有利于减少传质阻力等优点，因此，本试验主要考察水和乙醇作为提取溶剂的效果。

精确称取1.00 g菠萝皮样品，分别加入水和不同浓度的乙醇溶液50 mL，于80℃水浴浸提2 h，离心抽滤，定容，按1.4.4的方法测定黄酮含量（其余同）。

由图1可知，80%，60%乙醇分别为冬、夏季菠萝皮中黄酮类化合物的最佳提取溶剂，黄酮含量分别达9.98，4.52 mg/g，分别是水提取含量的1.83倍和2.27倍。水和过低浓度的乙醇溶液会使无机盐、蛋白质、淀粉和果胶等杂质溶出，而过高浓度乙醇亲脂性强，脂溶性物质溶出会增加，干扰因素增多[23-24]，这些干扰成分（醇溶性杂质、色素等）会与乙醇-水分子结合，使黄酮与乙醇-水分子结合的机会减少，从而导致黄酮类化合物的含量下降[25]。

2.1.1.2 料液比对提取效果的影响 取1.00 g菠萝皮样品，分别以料液比 1∶10，1∶30，1∶50，1∶70加入75%乙醇至50 mL，80℃水浴浸提2 h，离心抽滤，定容，测定黄酮含量。

图2表明，冬季菠萝皮黄酮含量在料液比1∶30时最大，达11.09mg/g，是1∶10的8.66倍；而夏季菠萝皮黄酮含量在料液比1∶50时最大，为5.33 mg/g，是1∶10的2.99倍。随着料液比的增大，黄酮类物质的溶出量会增加，但料液比达到一定值后，一方面由于黄酮逐渐达到溶解平衡，另一方面由于杂质溶出增加均会影响提取结果[26]。

2.1.1.3 提取温度对提取效果的影响 取1.00 g菠萝皮样品，加入75%乙醇50 mL，分别在20，40，60，80℃下浸提2 h，离心抽滤，定容，测定黄酮含量。

图3表明，随提取温度的升高，冬、夏季菠萝皮黄酮含量分别从2.43，0.68 mg/g（20℃）提高到8.22，3.54 mg/g（80℃），含量显著提高。其原因可能是温度提高后提取溶剂的黏度下降，分子运动加速，溶解速度加快，有助于黄酮的溶出。但由于乙醇沸点为75℃左右，温度的升高和加热时间的延长，容易使其过快挥发，造成溶剂损失，且会导致黄酮结构被氧化破坏。同时也使一些非黄酮类物质更易进入溶剂系统，干扰黄酮浸出率。所以，不宜进一步升高温度。

2.1.1.4 提取时间对提取效果的影响 取1.00 g菠萝皮样品，加入75%乙醇至50 mL，于80℃下分别水浴浸提 0.5，1，2，3，4 h，离心抽滤，定容，测定黄酮含量。

从图4可以看出，提取时间在0.5～1 h之间时，冬季菠萝皮的黄酮含量随提取时间增加明显，之后含量增速减慢，1，2 h的黄酮含量分别为10.09，10.50 mg/g，推测原因可能是1 h后提取溶剂和样品这2个体系中的黄酮浓度已相差不大，传质推动力下降，黄酮类化合物溶出缓慢[23]；2 h之后，在2个体系传质推动下，部分黄酮类化合物被氧化破坏，含量出现下降的趋势；3 h时，含量为8.73 mg/g，这可能是因为长时间的热效应，影响了黄酮类物质的化学结构，也可能是因为溶出了更多的杂质，影响了黄酮类化合物的溶解度，从而影响了其含量[27]。综合考虑经济、效率等因素，冬季菠萝皮提取时间取1 h。夏季菠萝皮中黄酮含量的变化趋势与冬季类似，提取2，3 h的黄酮含量分别为3.40，3.41 mg/g，所以，提取时间取2 h。

2.1.2 正交试验结果 试验结果（表3，4）表明，冬季菠萝皮黄酮的适宜提取工艺为80%乙醇为提取溶剂，料液比1∶40，80℃提取1.5 h，此条件下黄酮含量可达12.80 mg/g，4种因素对提取结果的影响从大到小依次为：提取温度＞乙醇浓度＞提取时间＞料液比；夏季菠萝皮黄酮的适宜提取工艺为50%乙醇为提取溶剂，料液比1∶40，80℃提取1.5 h，此条件下黄酮含量可达4.41 mg/g，4种因素对提取结果的影响从大到小依次为：提取温度＞料液比＞乙醇浓度＞提取时间。结果同时表明，冬季菠萝皮黄酮含量明显高于夏季菠萝皮黄酮的含量（约为夏季的2.90倍），这可能与菠萝的成熟度不同有关，张秀梅等[28]的研究也发现，不同成熟度菠萝果实的营养成分含量差异明显。

表3 冬季菠萝皮黄酮化合物提取正交试验结果

表4 夏季菠萝皮黄酮化合物提取正交试验结果

2.2 菠萝皮中黄酮类化合物的稳定性研究

2.2.1 光照的影响 从图5，6可以看出，菠萝皮黄酮对光敏感，随着光照时间的延长，黄酮溶液吸光度值下降，在光照20 h后，冬、夏季菠萝皮黄酮吸光度值分别下降了90.81%和71.02%，而在避光条件下仅下降了1.77%和0.56%。这可能是光照使黄酮物质先发生自身的氧化聚合，之后又发生降解[23]，所以，菠萝皮黄酮在贮存和使用过程中应避免阳光直射。

2.2.2 碳水化合物的影响 在4支（其中1支为对照）25 mL的具塞试管中各加入2/3体积的菠萝皮黄酮提取液，然后再分别加入葡萄糖、蔗糖、淀粉各0.1 g，室温下分别放置0，24 h。同时以不添加碳水化合物为对照。

从图7，8可以看出，24 h后，黄酮提取液吸光度值都呈现出上升的趋势，淀粉和葡萄糖的作用尤为明显，因而，黄酮在贮藏、使用中均宜与糖共处。

2.2.3 氧化剂、还原剂的影响 取样液10 mL，分别加入质量分数为2%Vc，2%H2O2，氧化亚铁及水各 40 μL，室温下放置 0，1，24 h。

由图9，10可知，H2O2使冬季菠萝皮黄酮含量下降，而对夏季无明显影响，说明冬季菠萝皮黄酮对氧化剂更敏感；Vc对冬季菠萝皮黄酮无明显影响，而使夏季黄酮含量下降，可能黄酮成分与维生素发生了缩合反应，聚合或降解产物对黄酮含量有一定影响[27]；氧化亚铁能使样液中黄酮含量上升，Das等指出，黄酮类化合物的酮基和3-位或5-位羟基联合作用，可螯合金属离子，削弱微量金属的助氧化作用[29]，说明菠萝皮黄酮与亚铁离子产生络合反应，因此，能阻断由亚铁离子催化的氧化反应。

2.2.4 金属离子的影响 分别配制 K+，Na+，Cu2+，Zn2+，Al3+，Mg2+，Ca2+溶液 1mg/mL，Fe3+溶液 50μg/mL。取一定量样液，分别加入不同金属离子溶液，分别放置 0，1，2，3，4 d，测定其吸光度值。

从 图 11，12 可 以 看 出 ，K+，Na+，Al3+，Mg2+，Ca2+对菠萝皮黄酮无明显影响，Cu2+，Zn2+，Fe3+使黄酮含量下降，Fe3+，Zn2+的影响尤其明显。其原因可能是Fe3+属于过渡金属离子，最外层有不成对的电子，而Cu2+虽然不完全符合过渡金属离子的定义，但Cu2+是Cu的4s轨道和3d轨道各失去1个电子而形成的，因此，也具有不成对电子，它们都易于与黄酮类化合物中酚羟基形成络合物；另一方面，Cu2+，Zn2+，Fe3+作为中心离子形成配离子时一般都具有颜色，从而影响了黄酮类化合物的吸收光谱[27]。

2.3 菠萝皮中黄酮类化合物的抗氧化性研究

由图13可知，2种菠萝皮黄酮提取物均具有清除DPPH自由基的能力，且黄酮提取物的浓度和抗氧化性之间成一定的剂量-效应关系。

冬季菠萝皮黄酮对DPPH自由基的抑制率分别达 52.60%，90.40%，93.01%，94.10%和 95.40%；夏季的抑制率分别达84.30%，91.00%，94.41%，95.20%和96.73%，表现出较冬季菠萝皮更强的抗氧化活性，这可能是由2种季节菠萝皮黄酮的成分、结构、纯度以及与糖的结合程度不同等因素所致[30-32]。

3 结论

3.1 菠萝皮黄酮类化合物提取工艺

冬、夏季菠萝皮分别以80%，50%乙醇为提取剂，均在料液比为1∶40，温度为80℃下浸提1.5 h，黄酮含量分别达12.80，4.41 mg/g。其中，浸提温度对提取效果的影响最大。

3.2 菠萝皮黄酮类化合物的稳定性

菠萝皮黄酮对光敏感；淀粉、葡萄糖和蔗糖对黄酮类化合物有一定的保护作用；冬季菠萝皮黄酮稳定性受氧化剂影响大，而夏季菠萝皮黄酮受还原剂影响大；K+，Na+，Al3+，Mg2+，Ca2+对菠萝皮黄酮无明显影响，而Fe3+，Zn2+，Cu2+对黄酮类化合物有不良影响。

3.3 菠萝皮黄酮类化合物的抗氧化性

冬、夏季菠萝皮黄酮均表现出较强的清除DPPH自由基的能力，且成一定的剂量-效应关系，夏季菠萝皮黄酮的抗氧化活性强于冬季。

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