葡萄抗根结线虫资源筛选

刘三军，章 鹏，宋银花，贺亮亮

（中国农业科学院郑州果树研究所，河南 郑州 450009）

根结线虫（Meloidogynespp.）病是我国葡萄生产重要的病害之一，给葡萄生产带来了重大损失。加之在防治技术措施上的不力及防治困难，线虫病害越来越严重。根结线虫病害在我国各葡萄产区广泛分布，并由北方传统葡萄产区向四周迅速扩散，危害范围逐年扩大，已经成为重要的土传病害。

筛选抗根结线虫的葡萄种质资源一直为人们所关注，筛选后的抗性种质材料一方面可以直接利用，另一方面可以通过育种，培育抗性材料加以间接利用。因此，抗线虫种质材料的筛选是利用抗性资源的基础。

我国具有丰富的野生葡萄资源，据报道，分布于中国的葡萄野生资源有56种之多，加之我国从国外引入的葡萄品种、砧木等资源，形成了我国葡萄种质资源的多样化，其中有很多抗葡萄根结线虫的资源类型。

为了对我国原产的葡萄野生种类、栽培品种、砧木品种及部分山欧杂种后代进行抗根结线虫病害评价，试验选择了10份原产我国的野生资源、4份普遍栽培的葡萄品种、20份葡萄砧木品种及4份山欧杂种共38份材料，进行葡萄抗根结线虫的鉴定和筛选。

1 材料

1.1 葡萄试材

供试材料全部来源于中国农业科学院郑州果树研究所葡萄国家种质资源圃。试材涵盖了目前我国主要野生种类、生产上主要使用砧木品种、主要栽培的葡萄品种及山葡萄与欧洲种群葡萄杂交后代。试材共38份，具体如下。

中国葡萄野生资源10份：

山葡萄（Vitis amurensisRupr.）、毛葡萄（V.quinquangularisRehd）、刺葡萄（V.davidiiFoex）、复叶葡萄（V.piasezkiiMaxim）、燕山葡萄（V.yanshanensis）、葛藟（V.flexuosaThunb）、华东葡萄（V.pseudoreticulataW.C.Wang）、 蘡 薁（V.adstrictaHance）、华北葡萄（V.dryonifoliaBunge）、小果葡萄（V.balansenanPlanch.）

栽培品种4份：

巨峰（Kyoho）、红地球（Redglobe）、维多利亚（Victoria）、夏黑（Summer Black）。

砧木品种20份：

V.rupestrisScheele 1份Rupestris 2；

V.ripariaMichawx 7 份：Barrett50、Eldorado、Grand Glaber、Macadams、Gloire、Pulliat、Riparia580。

V.champiniPlanch 2 份：Dog Ridge、Champini。

V.doanianaMunson 1份：Salt Creek.

V.berlandieri Planch×V.raipiria3 份 ：5BB、SO4、5C。

V.riparia×V.rupestris1 份：3309P 。

V.riparia-rupestris-candicams×V.labrusca-riparia-vinifera1份：1613C。

V.riparia-rupestris-candicams×V.labrusca-riparia-vinifera×V.champini1份：Freedom。

V.laburusca×V.rupestrisScheele 1 份：贝达（Beta）

Rupestris580×SO4：抗砧 3号（Kangzhen 3），中国农业科学院郑州果树研究所选育。

华东葡萄（V.pseudoreticulata）×佳丽酿（V.viniferaC.V.Carignane）1份：华佳8号。由上海农业科学院院林业果树研究所育成。

山欧杂种4份：即我国原产的野生山葡萄（Vitis amurensisRupr.）与欧洲种群的栽培品种玫瑰香（V.vinifera C.V.Muacat Hamberge）等的杂交后代。由中国科学院北京植物园选育。

北醇（玫瑰香×山葡萄；Beichun：Muacat Hamberge×Vitis amurensis）

北红（玫瑰香×山葡萄；Beihong：Muacat

Hamberge×Vitis amurensis）

北全（北醇×大可满；Beiquan：Beichun×Gros

Colman）

熊岳白（（玫瑰香×山葡萄）×龙眼；Xiongyue

bai：（（MuacatHamberge ×Vitisamurensis） ×Longyan）

1.2 根结线虫材料

根结线虫（Root-knot nematode，RKN），采集感染线虫葡萄根系，带回实验室，用强水流冲洗，选择膨大根结，挑取成熟雌虫和卵囊备用。同时采集根结线虫危害严重地块的土壤，编号备用。其编号和来源见表1。

表1 根结线虫样品编号与来源

2 方法

2.1 试材准备

2.1.1 葡萄枝条扦插基质的配制

将细沙和草炭土分别过60目（直径0.4mm）筛子过筛，灭菌后按照细沙：蛭石=2∶1的配方配制营养土，作为葡萄绿枝扦插和硬枝扦插的基质。装盆待用。

2.1.2 葡萄试材的处理和扦插

（1）试材处理。将田间采回的葡萄枝条（绿枝或硬枝）按照葡萄扦插要求进行处理，处理的方法为：将葡萄枝条修剪成15cm左右带2个饱满芽的插条，上端距离芽眼2cm剪成平口，下端在芽眼的另一侧稍下剪成马蹄形，每个种、品种共计100个插条。

（2）扦插。将准备好的葡萄枝条，在清水中侵泡12～24h，随后，用100mg/L的生根粉处理12h，每20根插条为1个处理，重复5次。按照葡萄扦插育苗的程序进行正常管理。绿枝扦插苗，配置微喷，以促使苗木的成活和生长。

2.1.3 根结线虫虫源

将获得的成熟雌虫和卵囊进行孵化，进行单卵块繁殖，收集2龄幼虫，1000条/mL，接种于盆栽的番茄上，以制备根结线虫根结。

2.1.4 接种

当葡萄试材生长至4～6片叶、根系分布营养土的1/2～3/4时，接种根结线虫毒土，每盆接种5～10g根结，根结来自于盆栽番茄繁殖的根结线虫。同时，每处理设置2盆为对照。

2.1.5 采样

接种70d后，开始挖取葡萄植株根系，在挖取时，应保持植株根系的完整性。挖取植株后，进行各种数据的调查。

2.2 调查方法与抗性等级划分

2.2.1 感染率测定及抗性等级划分

每处理选取10株，调查每植株根系总根数和形成根结的根数量，根据感染情况，将植株抗性划分为5个等级，如下：

0级：感染率为0，即无根系形成根结，抗性为免疫（I or HR）。

1级：感染率为0%～10%，即根系形成少量根结，抗性为高抗（HR）。

2级：感染率为11%～20%，抗性为中抗（MR）。3级：感染率为21%～50%，为中感（MS）。4级：感染率为51%～100%，为高感（HS）。

2.2.2 根结数量测定

每个处理随机抽取10株，随机剪取20～30g根，统计计算根结指数，根结指数为每克根系的根结数量。

2.2.3 根围线虫数量测定

接种后70d，每处理取盆土100g，用筛淘-离心组合法分离根围根结线虫，显微镜下统计线虫数量。

2.2.4 感染时间测定

每处理设置5盆，每7d取盆土和根系各1次，连续测定5次，计算根围线虫数量和根结的形成，并计算根结指数。

3 结果与分析

3.1 中国野生葡萄资源对根结线虫抗性

原产我国的葡萄野生种接种根结线虫后的抗性点差结果表明：小果野葡萄抗根结线虫能力弱，为高感（HS）类型。在根结线虫接种14d后，即形成大量的根结，根围线虫数量多，至70d后采样发现，其根系已经布满根结，根结指数达到83.17（表2，图1），健康根系很少，并且新根数量发生较少，地上部分表现为植株生长势下降，生长衰弱，新梢抽生受阻。

图1 不同葡萄种间接种根结线虫后的表现

葛藟葡萄在接种后，前期生长量上升较快，根结线虫繁殖速度较快，但形成根结速度较慢。但70d后，根结形成布满根系，树势衰弱速度加快，表现为中感（MS）类型，燕山葡萄、山葡萄的抗线虫性与葛藟相似。

毛葡萄、华东葡萄植株生长健康、正常，通过连续的观察，根结形成较慢，根围线虫数量上升较慢，至70d后的采样，根结指数分别为：9.14、6.43，根围线虫数量比其他种类数量少，表现为高抗（HR）根结线虫。

华北葡萄、复叶葡萄、刺葡萄和蘡薁的表现介于抗、感之间，形成根结速度较慢，根围线虫数量介于抗感之间，为中抗（MR）类型。

根据连续观察和接种后70d的综合表现，根据葡萄对根结线虫的抗、感性分级标准，可以将原产我国的葡萄野生种类的抗根结线虫能力分为4个类型。第一类为高抗资源（HR），分别为华东葡萄和毛葡萄；第二类为中抗资源（MH），分别为复叶葡萄、刺葡萄、蘡薁和华北葡萄；第三类为中感（MS）资源，分别为燕山葡萄、山葡萄和葛藟；第四类为高感（HS）资源，小果野葡萄。

综上所述，我国原产的葡萄野生种类中，无免疫类型发现，但存在高抗类型。

3.2 生产上常用的葡萄栽培品种对根结线虫抗性

从供试的4个主要栽培的品种来看，目前我国葡萄产区主栽品种均不抗葡萄根结线虫（表3）。接种后，葡萄根际线虫数量明显呈上升趋势，并于接种后14d达到第1次繁殖高峰，此时根结线虫主要来自于接种的根结，不能反映品种的抗性。接种后21d，根结线虫进入根系，造成根围线虫数量的降低，并于35d达到第2次侵染高峰。欧亚种的栽培品种红地球、维多利亚最早形成根结，并于第7天后根结指数持续上升，说明根结线虫持续侵染根系，植株抗虫性较弱，为高度感染类型。巨峰、夏黑为欧美杂种，在接种后的7～14d，根围线虫也呈现增高趋势，但形成根结时间晚于欧亚种的品种，在接种后21d，形成第一次侵染高峰，并于该时间后，形成持续侵染。说明欧美杂种的抗线虫性强于欧亚种的栽培品种。但总体来看，欧美杂种、欧亚种的葡萄栽培品种均不抗根结线虫，只是存在抗根结线虫的阶段性差异。

表2 中国野生葡萄资源对根结线虫的抗性分级

表3 4个主要栽培的葡萄品种抗线虫性

3.3 砧木品种对根结线虫抗性

葡萄砧木抗根结线虫性也存在较大的差异（表4）。根据连续观察和接种后70d的综合表现，来源于美洲的葡萄砧木品种，如3309P、Champini（香槟尼）、Dog Ridge（狗脊）、Riparia580（河岸580）等，具有良好的抗病性，在接种根结线虫后，无感染，形不成根结，表现为免疫或高抗，同时根围部位，根结线虫的繁殖受到抑制，说明美洲葡萄种及其种间杂种具有良好的抗根结线虫性能。

同样来源于美洲种间杂种的Grand Glaber、5BB、5C、Barrett50、Pulliat、Freedom 等葡萄砧木品种，对葡萄根结线虫具有良好的抗性，但由于部分砧木品种，如5BB等，加入了部分欧洲葡萄的血统，表现抗线虫性有所降低。

我国常用的葡萄砧木品种，如贝达、SO4等，对葡萄根结线虫表现为耐病，线虫可以在根围进行繁殖，部分品种可以形成少量的根结，为中抗类型。

表4 葡萄砧木对根结线虫的抗性

兼具有美洲葡萄血统、欧洲血统及其他外来血统的葡萄砧木品种，如 Salt Creek、Gloire、Eldorado、1613C、Rupestris 2（沙地葡萄 2）等则表现为中等感病和感病，这说明在葡萄砧木育种过程中，由于根据地域性的差异及生产需求（优质、抗病、适应性好等），加入了本地葡萄的优良基因，而造成葡萄抗线虫性的能力降低。

我国育成的葡萄砧木品种，抗砧3号、华佳8号在抗线虫性上具有较大差异。抗砧3号为美洲种间杂种后代通过杂交选育而成，其亲本为Riparia580（河岸 580）×SO4，河岸 580为根结线虫免疫（极抗）品种，SO4为中抗类型，其杂交后，抗线虫性有所降低，但仍表现为高抗根结线虫。华佳8号是采用欧亚种品种和我国原产的野生葡萄种选育而成，其亲本为佳丽酿（V.viniferaC.V.Carignane）×华东葡萄（V.pseudoreticulata），两亲本抗线虫性有较大差异，华东葡萄对葡萄根结线虫具有较好的抗性，而葡萄品种佳丽酿则是葡萄根结线虫高感品种，所以在本研究中，两者的杂交后代华佳8号，对根结线虫为中等感染类品种，说明葡萄抗根结线虫的能力与母本抗性有很密切的关系。

根据接种后的连续观察及接种后70d的调查，可以将20份葡萄砧木品种分为5个类型，如下：

第一类，砧木品种表现为免疫或极抗。有4个：3309P、Champini（香槟尼）、Dog Ridge（狗脊）、Riparia580（河岸 580）。

第二类，表现为高抗。有Grand Glaber、5BB、5C、Barrett50、Pulliat、Freedom、抗砧 3号。

第三类，表现为中抗。有贝达、SO4。

第四类，表现为中感。有Salt Creek、Gloire、Eldorado、Rupestris 2（沙地葡萄 2）、华佳 8号。

第五类，表现为易感。有Eldorado、Macadams、1613C。

3.4 山欧杂种对根结线虫的抗性

山葡萄是我国原产的葡萄野生种类，具有较强的抗寒性，为了更好地利用其抗性，前人进行了很多的杂交工作，育出了一批葡萄杂交品种（山欧杂种）。如北红、北醇、北全、熊岳白等。

从接种后70d的调查结果分析，山欧杂种均不抗葡萄根结线虫（表5）。但山欧杂种的抗线虫能力存在差异。接种后70d，北红、北全的根围线虫数量明显比北醇、熊岳白高，说明两个品种的根围线虫数量大，根系对根结线虫的繁殖能力抑制力弱于其他2个品种。从根系形成根结的程度分析，北全和熊岳白2个品种根系形成根结数量高于其他2个品种，说明2个品种抗根结线虫能力弱，因为北全是北醇和大可满（V.vinefera C.V.Cros Colman）杂种后代，是山欧杂种与欧亚种的杂交后代，欧亚种的遗传性更强，抗线虫能力下降而致。

4 讨论与结论

4.1 讨论

19世纪以来，由于葡萄根系的病害，特别是葡萄根结线虫、葡萄根瘤蚜的入侵，造成葡萄园的大量损失。以法国、德国为首的葡萄酒主产国家开展了长期的抗性砧木的育种工作。人们发现，以美洲种的河岸葡萄（V.ripariaMichaux）、沙地葡萄（V.rupestrisScheele）、冬葡萄（V.berlandieriPlanche）等为亲本产生的杂交后代，如5BB、5C、140Ru、SO4、3309P等，对根结线虫及根瘤蚜有极高的抗性。香槟尼葡萄（V.champiniPl.）的一些种间杂种后代，如DogRidge，对根结线虫的抗性极高。但国外抗葡萄根结线虫育种的主攻方向局限于抗剑线虫（Xiphinema），因为该属中的多种线虫能传播葡萄病毒病，特别是危害巨大的扇叶病毒。而目前发现的抗剑线虫的葡萄大多属于圆叶葡萄（V.rotundifolia）或是种间杂种后代。

目前，生产上利用抗性砧木及其他抗性材料是葡萄抗根结线虫的主要手段，葡萄抗线虫性的提高，则主要靠育种手段解决。但葡萄对根结线虫的抗性鉴定方法多种多样，导致鉴定结果也是多种多样，在实际应用中很难界定葡萄种质资源的抗线虫性，因此，葡萄对根结线虫的抗性的鉴定就显得尤为重要。目前，葡萄抗根结线虫的主要鉴定方法通常是基于葡萄根系形成根结的能力，即根结指数（galling Index，GI）的大小，主要原因是根结形成就代表线虫的成功寄生，即线虫侵入了葡萄根系，并形成根结。同时，寄主抗根结线虫的反应，如侵入和根结形成的过程，在葡萄抗根结线虫的鉴定中往往被忽视，一些葡萄品种，在根结线虫高发地区，往往不显现任何症状，而且根结线虫对产量和生长势没有影响，另外一些葡萄品种，对根结线虫的反应极为敏感，有少量的根结线虫则对植株生长势和产量造成严重的影响，因此，研究葡萄对根结线虫的抗性分级标准及抗性资源的筛选是本研究的重要目的之一。

关于我国葡萄属植物、引进的葡萄砧木品种及我国育成的葡萄山欧杂种的抗根结线虫鉴定，前人已经做了一些工作，但由于供试材料受限或鉴定方法的不完善，造成鉴定结果的差异很大。因此，本研究主要以根结线虫侵入后，在不同时期进行采样，结合根结线虫侵入后的过程以及整个生长季节过后的根结形成作为主要指标，并检测葡萄根系根围线虫的数量，作为葡萄种质资源抗根结线虫的指标，来进行葡萄抗根结线虫的鉴定指标，全面的反映了葡萄抗根结线虫的过程及最后的结果。

对38份葡萄种质资源的鉴定结果可以看出，我国野生的葡萄资源，对根结线虫的抗性差异很大，除部分野生资源，如华东葡萄（V.pseudoreticulata）、毛葡萄（V.quinquangularis）具有高抗线虫之外，大部分原产我国的葡萄野生种类对线虫是感病的。

表54 个山欧杂种对葡萄根结线虫抗性

我国引进的的砧木品种，在对根结线虫的抗性上也有很大的差异，我国目前生产上利用最多的葡萄砧木，如贝达（Beta）、5BB、SO4等，多是高抗或抗，没有发现对根结线虫免疫的类型。而一些对根结线虫免疫的砧木品种，如3309P、Champini（香槟尼）、DogRidge（狗脊）、Riparia580（河岸 580）等，因具有美洲种的血统，不适应我国的气候条件及土壤条件，生产势弱，作为葡萄苗木生产的砧木育苗，需要时间更长，因此生产上利用率较低，如何提高其适应性，有待进一步的工作。

同时，在本试验中，选取的葡萄品种，如巨峰（Tokyo）、红地球（Red Globe）、夏黑（Summer Black）、维多利亚（Victoria），虽然存在对根结线虫的抗性差异，但对根结线虫的反应则更为敏感，全部为高感类型，因此，我国目前栽培的葡萄品种，基本没有对根结线虫高抗的类型，在生产上应当引起高度的重视。

原产我国东北的山葡萄（V.amurensis）在我国北方长期应用于抗寒砧木或应用于葡萄抗寒育种的主要材料，目前，利用山葡萄的抗性育种，主要是山葡萄—欧亚种（Amurensis-Vinifera）之间，从本试验的鉴定结果来看，山葡萄、欧亚种对根结线虫的抗性为中度敏感或高度敏感的类型，从遗传角度来看，其后代基本无抗线虫的后代，试验结果也证明了该种观点，尽管如此，山欧杂种后代的抗根结线虫能力也存在差异，主要原因是在杂交后代中，欧亚种品种的遗传力在杂交后代中的比例，试验中的北醇、北全等，欧亚种的特征更为明显一些，其抗根结线虫能力较差一些，鉴定结果与贺普超等的结果一致。

通过对我国目前生产上常用的葡萄品种、砧木品种和我国原产的葡萄野生种质资源进行抗根结线虫的鉴定，取材全面，对我国葡萄品种及野生种的抗线虫性鉴定，为今后抗性资源的利用及育种，尤其地利用野生资源的抗性育种，具有极为现实的意义。

4.2 结论

对20份葡萄砧木品种、4份栽培品种以及4份山欧杂种的鉴定结果表明，葡萄种质资源间抗根结线虫的能力有很大差异，抗性分为5种类型，即免疫（I）、高抗（HR）、中抗（MR）、中感（MS）和高感（HS）类型。

原产我国的葡萄野生资源，没有免疫类型，供试的10个种对根结线虫的抗性划分为4个类型，第一类为高抗资源（HR），分别为华东葡萄和毛葡萄；第二类为中抗资源（MH），分别为复叶葡萄、刺葡萄、蘡薁和华北葡萄；第三类为中感（MS）资源，分别为燕山葡萄、山葡萄和葛藟；第四类为高感（HS）资源，小果野葡萄。

从供试的4个主要栽培的品种来看，目前我国葡萄产区主栽品种均不抗葡萄根结线虫。但存在抗根结线虫的阶段性差异，欧美杂种的抗线虫性强于欧亚种的栽培品种。

砧木品种的抗线虫性有很大差异，供试20份葡萄砧木品种分为5个类型，第一类，砧木品种表现为免疫或极抗。有4个：3309P、Champini（香槟尼）、Dog Ridge（狗脊）、Riparia 580（河岸580）。第二类，表现为高抗。有Grand Glaber、5BB、5C、Barrett50、Pulliat、Freedom、抗砧 3号。第三类，表现为中等抗性。有贝达、SO4。第四类，表现为中等感染。有 Salt Creek、Gloire、Eldorado、Rupestris 2（沙地葡萄2）、华佳8号。第五类，表现为感染。有 Eldorado、Macadams、1613C。

供试的4份山欧杂种均不抗葡萄根结线虫，但山欧杂种的抗线虫能力存在差异，抗性能力的高低与欧亚种的对后代遗传力有密切关系。