一种新的沙丁胺醇人工抗原的合成及单克隆抗体的制备

陈观银，黄显会，刘晓云，邓发亮，李帅鹏，孔祥凯，怀彬彬

(1华南农业大学兽医学院，广东广州 510642;2广州万孚生物技术股份有限公司，广东广州 510642)

一种新的沙丁胺醇人工抗原的合成及单克隆抗体的制备

陈观银1，黄显会1，刘晓云2，邓发亮2，李帅鹏1，孔祥凯1，怀彬彬1

(1华南农业大学兽医学院，广东广州 510642;2广州万孚生物技术股份有限公司，广东广州 510642)

【目的】为证明采用4-溴丁酸乙酯半抗原合成人工抗原可制备灵敏度高、特异性好的单克隆抗体.【方法】将硫酸沙丁胺醇(SAL)与4-溴丁酸乙酯反应制备半抗原(SAL-HS);通过N-羟基琥珀酰亚胺活化酯法合成免疫原与包被原，用聚丙烯酰胺凝胶电泳、紫外光谱和质谱方法对沙丁胺醇免疫原及包被原进行鉴定.免疫原免疫Balb/c小鼠，采用融合技术产生杂交瘤细胞株，体内诱生腹水法制备单克隆抗体，并鉴定其免疫学特性.【结果和结论】筛选出1株杂交瘤细胞株，其细胞培养上清液效价达1∶128 000，腹水效价达1∶2 560 000，免疫球蛋白亚型鉴定为IGg 1;抗体对沙丁胺醇的半数抑制浓度(IC50)为：0.746 ng/mL;与其他同类结构药物的交叉反应率均小于0.015%.

沙丁胺醇;单克隆抗体;胶体金;间接竞争ELISA

沙丁胺醇(Salbutamol，SAL)，又名舒喘宁、索布胺、阿布叔醇、羟甲异丁肾上腺素、羟甲叔丁肾上腺素等，化学名1-(4-羟基-3-羟甲基苯基)-2-(叔丁氨基)乙醇［1］，是一种人工合成的β2肾上腺素受体激动剂(β2-激动剂)［2］，其中有活性作用的是R型沙丁胺醇，临床常用其硫酸盐形式治疗支气管哮喘［3］.此外，沙丁胺醇还具有一定的营养重分配作用［4-5］，摄入量过大时对心血管系统和神经系统会产生明显的刺激作用，引起肌肉颤抖、心悸、心慌、头疼、目眩，严重者恶心、呕吐等.由于沙丁胺醇对动物具有促进骨骼肌生长，减少脂肪蓄积作用，因而被国内外不少养殖场非法用作饲料添加剂，其残留严重危害着人们的身体健康和生命安全.为防止沙丁胺醇超标的畜产品进入市场，必须建立一种简便、快速、灵敏、准确的检测方法，对沙丁胺醇残留进行有效的监测.目前，沙丁胺醇的残留检测主要依靠理化检验方法，如气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)［6-7］、气质联用(GC-MS)［8-9］、液质联用(HPLC-MS)等［10］，尽管这些方法有很高的灵敏度和准确性，但存在需要昂贵的仪器、样品前处理复杂、繁琐费时、不能现场操作等缺陷，限制了理化检验方法的应用［11］.免疫学分析方法由于具有灵敏、快速、特异、简便等优点，近年来国内外在兽药、农药残留检测领域广泛应用［12-16］.本研究采用溴丁酸乙酯法合成沙丁胺醇免疫原，制备沙丁胺醇单克隆抗体，应用于胶体金平台，旨在为沙丁胺醇残留免疫学检测方法的建立奠定基础.

1 材料与方法

1.1 试剂

硫酸沙丁胺醇(江苏金坛)(结构见图1);4-溴丁酸乙酯(Sigma公司);牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵清白蛋白(OVA)(上海金穗生物科技有限公司); 1-乙基3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酸亚胺(NHS)(阿拉丁试剂公司);PEG1500、弗氏完全佐剂、弗式不完全佐剂(Sigma公司);SP2/0细胞(广州万福生物技术公司); HAT、HT、RPMI-1640培养基(美国Gibico公司);其他试剂市售所得，均为AR级.

图1 沙丁胺醇化学结构Fig.1 The chemical structure of salbutamol

1.2 主要仪器

U3000紫外扫描仪(UV)(日本岛津公司);洗板机、酶联免疫检测仪、离心机(Thermo Scientific);磁力搅拌器(巩义市予华仪器);旋转蒸发仪(上海爱朗仪器);TC-2323CO2培养箱(SHELDON公司).

1.3 人工半抗原合成

硫酸沙丁胺醇500 mg(2.1 mmol)、碳酸钾718 mg(5.23 mmol)、4-正丁基碘化胺50 mg(0.135 mmol)、二甲基甲酰胺(DMF)5 mL、4-溴丁酸乙酯497 mg(密度为1.363 g/mL)，按上述顺序依次加入开始反应，TLC板跟踪反应情况，大约反应24 h，用水和乙酸乙酯开始萃取，旋转蒸干，称其质量为776 mg，加氢氧化锂600 mg、水3.6 mL和乙醇3.6 mL开始水解.TLC板跟踪，反应1.5 h后，旋转蒸干乙醇，加入三氯甲烷除去碱性条件下不成盐的副产物，倒掉，加约1.5 mL水，调pH为3～5，然后加过量的无水硫酸钠、甲醇和乙酸乙酯(体积比2∶8)开始萃取，蒸干有机相得目标产物(SAL-HS).反应原理见图2.

图2 半抗原合成过程Fig.2 The synthetic procedure for hapten

1.4 完全抗原的合成

半抗原(SAL-HS)与牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白偶联分别合成免疫原和包被原(图3).

1.4.1 免疫原合成将100 mg 4-溴丁酸乙酯沙丁胺醇半抗原溶于1 mL DMF中，取200 μL该溶液加入1 mL DMF，再加入15 mg EDC、10 mg NHS，常温反应过夜.将40 mg牛血清白蛋白溶于3 mL PBS (0.05 mol/L pH 7.4)中，将活化好的半抗原逐滴加入到溶于牛血清白蛋白的PBS中，室温磁力搅拌反应4 h，转入透析袋中开始透析(0.01 mol/L pH 7.4 PBS)，3 d后，4℃条件下保存备用.

1.4.2 包被原合成将100 mg 4-溴丁酸乙酯沙丁胺醇半抗原溶于1 mL DMF中，取200 μL该溶液加入1 mL DMF，再加入15 mg EDC、10 mg NHS，常温反应过夜.将100 mg鸡卵清白蛋白溶于3 mL PBS (0.05 mol/L pH 7.4)中，将活化好的半抗原逐滴加入到溶于鸡卵清白蛋白的PBS中，室温磁力搅拌反应4 h，转入透析袋中开始透析(0.01 mol/L pH 7.4 PBS)，3 d后，4℃条件保存备用.

图3 完全抗原合成过程Fig.3 The synthetic procedure for complete antigen(R represents hapten)

1.5 抗原合成鉴定

1.5.1 完全抗原浓度的测定采用福林酚法测定抗原的浓度［17］.

1.5.2 偶联比测定采用三硝基苯磺酸法测定免疫原和包被原偶联比［18］.

1.5.3 紫外光谱鉴定将抗原用水稀释到0.2 mg/mL，半抗原用少量DMF溶解，用水配成0.2 mg/mL牛血清白蛋白用水配成0.2 mg/mL，在200～400 nm范围内进行紫外扫描，可以很好地取得结果.

1.5.4 SDS-PAGE鉴定配制各种电泳溶液，浓缩胶5%，分离胶12%.考马斯亮蓝染色液染色，用脱色液脱色至条带清晰.

1.5.5 半抗原质谱鉴定参考毛利莎等［3］质谱条件，进行沙丁胺醇半抗原的质谱全扫描.

1.6 沙丁胺醇单克隆抗体的制备

1.6.1 动物免疫将免疫原SAL-BSA免疫5只Balb/c小鼠，分别标记为1、2、3、4、5，用牛血清白蛋白直接免疫Balb/c小鼠，作为空白对照组(标记为6)，首免将等量的抗原与弗氏完全佐剂乳化，腹部皮下注射100 μg/只，第2～第5次免疫，将等量免疫原与弗氏不完全佐剂乳化，皮下注射50 μg/只，融合前3 d加强免疫，皮下注射免疫原50 μg，免疫间隔时间为2周.

1.6.2 间接ELISA测定血清效价小鼠五免后第7天采血测定其血清抗体效价.方法如下：将SAL-OVA包被原用碳酸缓冲液(pH 9.6)稀释成1.0 μg/mL，包被96孔板，4℃条件孵育过夜，洗板3次;加入倍比稀释好的抗体，每孔100 μL，37℃条件孵育1 h，洗板3次;加入羊抗鼠IgG-HRP，每孔100 μL，37℃条件孵育40 min，洗板3次;加入显色液各50 μL，37℃条件显色10 min，0.2 mol/L硫酸终止反应，酶标仪450 nm读数.以S/N≥2.1所对应的最大稀释倍数为阳性血清的抗体效价，其中S为阳性血清的D450nm，N为阴性血清的D450nm.

1.6.3 间接竞争ELISA测定血清IC50根据1.6.2结果将D450nm在1.0左右的抗体稀释倍数作为最佳工作条件，按1.0 μg/mL包被原包96孔板(100 μL/孔)，洗板3次;然后加入沙丁胺醇标准品(1、10、20、40、80 ng/mL)各50 μL，再加入阳性血清50 μL，使最终浓度为最佳工作浓度.37℃竞争反应1 h，洗板3次;然后加入羊抗鼠IgG-HRP，每孔100 μL，37℃孵育40 min，洗板3次;再加入显色液，各50 μL，37℃显色10 min，0.2 mol/L硫酸终止反应，酶标仪450 nm读D450 nm.

1.6.4 细胞融合按常规方法融合，将SP2/0细胞与脾细胞以1∶5(质量比)比例混合，然后，将细胞混匀加入甲基纤维素半固体培养基中培养.培养步骤：将离心好的融合细胞，去除上清液，加入4 mL血清，并将细胞吹匀;然后再加入6 mL血清、4 mL饲养细胞及0.8～1.0 mL的HAT(50×);向离心管中加入25 mL灭菌半固体培养基，定容至40 mL，并将其充分混匀，30 min后将融合好的细胞倒入小皿中，再将小皿放入湿盒中，最后放入37℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养.1.6.5阳性细胞克隆检测细胞培养上清抗体效价，选择强阳性细胞进行克隆，取50个细胞铺半块96孔板，亚克隆后第4～5天数板，挑选单克隆或克隆数少的孔换液，第7～10天后(细胞占视野的25%以上)即可ic-ELISA检测，直至100%阳性.得到稳定分泌高特异性、高效价、高亲和力抗体的杂交瘤细胞株，保存于液氮中.

1.6.6 单克隆抗体的制备及其效价和亚型检测将克隆及扩大培养的杂交瘤细胞注入提前致敏的Balb/c小鼠腹腔，诱生腹水产生抗沙丁胺醇单克隆抗体.收集5 mL腹水进行抗体的纯化［19］，采用福林酚法测定抗体浓度;采用间接ELISA测定抗体效价;使用抗体亚型试剂盒(广州万孚生物技术责任有限公司产品)鉴定抗体亚型.

1.6.7 抗体灵敏度与特异性测定参照1.6.3，采用间接竞争ELISA法测定单克隆抗体的灵敏度和特异性.根据IC50判定抗体灵敏度.检测抗沙丁胺醇单克隆抗体与沙丁胺醇、盐酸克伦特罗、莱克多巴胺等的交叉反应性，根据交叉反应率(Cross reaction，CR)判定抗沙丁胺醇单克隆抗体的特异性.CR=(沙丁胺醇的IC50/各结构类似物的IC50)×100%.

2 结果与分析

2.1 半抗原质谱鉴定

溴丁酸乙酯半抗原相对分子质量为325.12，由图4可见，H+质谱出峰相对分子质量为326.3，表明是本试验所合成的半抗原.

图4 半抗原质谱图Fig.4 The mass spectrogram of SAL-HS

2.2 完全抗原鉴定

2.2.1 紫外光谱鉴定由图5可见，沙丁胺醇半抗原(SAL-HS)的最大吸收峰在275 nm，BSA的最大吸收峰在278 nm，沙丁胺醇半抗原和牛血清白蛋白偶联后在240～300 nm紫外吸收峰发生上移，表明偶联成功，依据三硝基苯磺酸法计算出沙丁胺醇半抗原和牛血清白蛋白结合比为13∶1.

由图6可见，沙丁胺醇半抗原(SAL-HS)的最大吸收峰在275 nm，鸡卵清白蛋白的最大吸收峰在279 nm，沙丁胺醇半抗原和鸡卵清白蛋白偶联后在240～300 nm紫外吸收峰发生上移，表明偶联成功，依据三硝基苯磺酸法推算出沙丁胺醇半抗原和牛血清白蛋白结合比为3∶1.

2.2.2 SDS-PAGE鉴定由图7可见，牛血清白蛋白相对分子质量为67 000，而沙丁胺醇半抗原连接牛血清白蛋白后相对分子质量加大，迁移速度比牛血清白蛋白慢，由此可见合成完全抗原成功.

图5 沙丁胺醇半抗原(SAL-HS)、牛血清白蛋白(BSA)、SAL-BSA的紫外扫描光谱Fig.5 UV absorption spectra of bovine serum albumin(BSA)，salbutamol hapten(SAL-HS)，and coating antigen (SAL-BSA)

图6 沙丁胺醇半抗原(SAL-HS)、鸡卵清白蛋白(OVA)、SAL-OVA的紫外扫描光谱Fig.6 UV absorption spectra of ovalbumin(OVA)，salbutamol hapten(SAL-HS)，and coating antigen(SAL-OVA)

图7 载体蛋白和偶联物的SDS-PAGEFig.7 SDS-PAGE of carrier proteins and conjugates

2.3 小鼠融合前血清抗体效价及IC50测定

五免后第7天的5只小鼠中，2号小鼠效价可达1∶128 000，其IC50为10.56 ng/mL.其他4只小鼠效价均可达1∶64 000，其IC50＞10.56 ng/mL.阴性对照鼠的效价可以达1∶2 000，但没有抑制，所以选择效价高、特异性好的2号小鼠进行融合.

2.4 小鼠杂交瘤细胞的建立

选择效价最高的2号小鼠进行融合.经阳性细胞克隆后，获得2株杂交瘤细胞，分别测定其IC50，筛选出1株高效价、敏感、特异的杂交瘤.

2.5 抗体的制备及纯化

将筛选得到的1株杂交瘤细胞注射到成年Balb/c小鼠腹腔，收集腹水，经蛋白纯化后，获得蛋白质量浓度为2.54 mg/mL.经间接ELISA效价检测，杂交瘤细胞株的细胞培养上清液和腹水抗体效价分别为1∶128 000和1∶2 560 000，经抗体亚型鉴定，细胞株所分泌的抗体均为IgG1.

2.6 抗体灵敏度与特异性测定

根据间接竞争ELISA结果，拟合曲线可得，单克隆抗体的IC50为0.746 ng/mL(图8)，与其他同类结构的交叉反应率均小于0.015%(表1).

图8 抗沙丁胺醇单克隆抗体标准抑制回归曲线Fig.8 Inhibitory curve determined by indirect competitive ELISA

表1 单克隆抗体与沙丁胺醇及其同类结构药物交叉反应率Tab.1 Cross-reactivity monoantibody with other drugs

3 讨论

沙丁胺醇是小分子，必须与大分子物质结合才具有免疫原性，而整个抗原合成中，半抗原结构设计尤为重要，直接影响动物的免疫效果，本研究的结构设计是新颖所在.以硫酸沙丁胺醇为原料，在酚羟基上接溴丁酸乙酯，因为沙丁胺醇相对分子质量很小，4-溴丁酸乙酯相对分子质量为195.05，增大相对分子质量同时，形成的醚链不容易水解，稳定性好，可以增强免疫原性.由于半抗原特殊结构，使得抗体与其他同类结构的交叉反应率小于0.015%，文献报道沙丁胺醇与克伦特罗有很高的交叉反应率［20］，这种半抗原结构的设计解决了交叉反应的问题，为创新所在.

免疫原偶联比为13∶1，能产生效价高的抗体，偶联包被原的半抗原和鸡卵清白蛋白质量比为1∶50，测得偶联比为2.5∶1，包被原偶联比越低包被效果越好.

在免疫小鼠检测小鼠血清抗体效价和抑制时，要选择效价高且抑制率高的小鼠进行融合，由于小鼠机体差异性，在免疫时应多免疫几只小鼠.由于融合时使用的是甲基纤维素半固体培养基，挑克隆之后要换全液，然后再检测效价和抑制，因为甲基纤维素半固体培养基可能会造成假阳性.

杂交瘤细胞株诱生腹水制备抗体的效价可达1∶2 560 000，其IC50可达到0.746 ng/mL，说明免疫原可以刺激动物机体产生免疫应答，从而制备高特异性的单克隆抗体.

免疫学方法具有灵敏度高、过程简单和分析速度快等优点，是监测食品安全很好的方法，将沙丁胺醇单克隆抗体应用到胶体金平台，省时、省力、成本低的胶体金试纸条，为沙丁胺醇残留检测提供了更加方便快速灵敏的方法，也为免疫学方法的建立奠定了基础，同时为胶体金试纸条的应用优化提供基础.

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【责任编辑柴焰】

Synthesis of a newly designed artificial antigen and preparation of a monoclonal antibody against salbutamol

CHEN Guanyin1，HUANG Xianhui1，LIU Xiaoyun2，DENG Faliang2，LI Shuaipeng1，KONG Xiangkai1，HUAI Binbin1
(1 College of Veterinary Medicine，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China; 2 Guangzhou Wanfu Biotechnology Co.，Ltd.，Guangzhou 510642，China)

【Objective】To prove that the artificial antigen which was synthesised by 4-bromine ethyl butyrate was successful，and that the monoclonal antibody had a high sensitivity and specificity.【Method】Salbutamol sulfate was connect with 4-bromine ethyl butyrate，then converted into hapten(SAL-HS).The immunogen SAL-BSA(salbutamol-bovine serum albumin)and coating antigen SAL-OVA(ovalbumin) were synthesized by the N-Hydroxy-succinimide active ester method.The conjugations were identified by SDS-PAGE，UV and mass spectrum.Balb/c mice were immunized by immunogen;splenocytes were fused with SP2/0 myeloma cells;hybridomas cells were produced for a monoclonal antibody by ascitesin vivoto identify immunological characteristics.【Result and conclusion】Cultural supernatants titer of hybridomas cells and ascites were 1∶128 000 and 1∶2 560 000 respectively;the subclasses of monoclonal antibody was IGg 1;the IC50of standard curve was 0.746 ng/mL，with other drugs of similar structure showing cross-reactivity affinities being less than 0.015%.

salbutamol;monoclonal antibody;immunogen;ic-ELISA

S859

A

1001-411X(2014)01-0023-06

陈观银，黄显会，刘晓云，等.一种新的沙丁胺醇人工抗原的合成及单克隆抗体的制备［J］.华南农业大学学报，2014，35(1)：23-28.

2013-02-21优先出版时间：2013-11-07

优先出版网址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.S.20131107.1610.016.html

陈观银(1987—)，女，硕士研究生，E-mail:344173825@qq.com;通信作者:黄显会(1969—)，男，高级兽医师，博士，E-mail:xhhuang@scau.edu.cn

国家科技支撑计划(2011BAK10B01-08)