生长相关优势基因型在大口黑鲈‘优鲈1号’选育世代中的聚合

徐磊，白俊杰，李胜杰，孙成飞

(1中国水产科学研究院珠江水产研究所/农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室，广东广州 510380;2上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306)

生长相关优势基因型在大口黑鲈‘优鲈1号’选育世代中的聚合

徐磊1，2，白俊杰1，李胜杰1，孙成飞1

(1中国水产科学研究院珠江水产研究所/农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室，广东广州 510380;2上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306)

【目的】以先前研究所获得的8个与大口黑鲈生长性状相关的分子标记为检测目标，分析其优势基因型在大口黑鲈选育群体中的分布数量，探索生长相关分子标记应用于大口黑鲈基因聚合育种的潜在可行性.【方法】采用STR基因分型技术对大口黑鲈‘优鲈1号’F2、F3、F5和F6选育群体的生长标记基因型进行检测，8个生长标记中含有4个单核苷酸多态性位点(分别位于IGF-I、POU1F1、PSSⅢ和MSTN基因上)和4个微卫星位点(分别是JZL60、JZL67、MisaTpw76和MisaTpw117).【结果和结论】试验鱼所含优势基因型的数量为0～6个，F2、F3、F5和F6选育群体中优势基因型的分子标记平均数量依次为2.12、2.70、2.90和3.08，呈现逐代递增趋势;优势基因型的分子标记数量与大口黑鲈生长速度呈同步递增趋势，说明人工选育在一定程度上聚合了优势基因.

优势基因型;聚合;STR;基因分型;大口黑鲈;选育

分子标记辅助选择(Marker associated selection，MAS)是利用分子标记在基因水平上对选择个体进行筛选，提高了选择育种的准确性与效率［1］.近年来随着生物技术的快速发展，使基于分子标记的数量性状位点(Quantitative trait locus，QTL)的分子标记辅助育种技术成为现实.鱼类的生长性状属于数量性状，是育种研究的一个重要指标，目前已经有研究报道了与生长相关的各种类型分子标记，如：黑龙江水产研究所对鲤鱼体长性状的研究发现有3个基因位点HLJ534、HLJ370、HLJ319可能与鲤鱼生长相关［2］.珠江水产研究所对草鱼生长性状的研究发现有1个生长性状的候选SNP标记［3］，有待于将分子标记辅助育种在实践中实现应用.

基因聚合最早由Yadav等［4］在研究芥菜抗病和抗逆性状改良时提出，许多研究者尝试开展数量性状的基因聚合研究，期望通过基因聚合技术加快育种进程.对风湿性关节炎性状的研究中发现，与抗该病相关的SNP标记优势基因型聚合的人，患病几率较低［5］.对鸡的肌内脂肪含量的性状研究发现，优势基因型聚合个体的肌内脂肪含量明显较高［6］.于吉英等［7］和李国辉等［8］对鸡产蛋以及Li等［9］对波尔山羊产仔性状的研究中均发现优势基因型聚合对性状改良有促进作用.目前关于生长相关基因聚合的研究鲜见报道，在中国美利奴羊［10］和淮猪［11］的研究中显示，与生长性状关联的优势基因型聚合程度越高，性状表现越优良;孙效文等［12］研究发现10尾极大个体中含有的生长相关优势基因型的数量要多于10尾极小个体.珠江水产研究所/农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室已经获得大口黑鲈Micropterus salmoides8个生长相关分子标记，与生长呈显著或极显著相关，其中4个单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms，SNPs)位点分别位于胰岛素样生长因子-Ⅰ(Insulin-like growth factor-Ⅰ)5'侧翼区域［13］、垂体特异性转录因子(Pituitary specific transcription factor1)启动子、生长抑素前体(Preprosomatostatin)启动子［14］和肌肉生长抑制素(Myostatin)［15］基因上，4个微卫星DNA位点分别为JZL60、JZL67、MisaTpw76和MisaTpw117［16］，有必要探索它们的聚合效应，进而对其有更好的利用.

大口黑鲈自20世纪80年代被引入我国，已成为主要的淡水经济养殖品种之一.针对大口黑鲈养殖群体出现的种质退化问题［17］，中国水产科学研究院珠江水产研究所经多年选育，培育出生长性状改良的优良养殖品种‘优鲈1号’，已通过全国水产原种和良种审定委员会审定.‘优鲈1号’比普通养殖大口黑鲈生长速度提高17.8%～25.3%［18］.本研究利用已经获得的8个大口黑鲈生长性状相关的分子标记来分析大口黑鲈选育世代含有的优势基因型的变化规律，研究结果可以为下一步生长性状相关标记的聚合选育提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

大口黑鲈‘优鲈1号’是被审定的国家级养殖新品种，试验所用的大口黑鲈选育鱼F6取自珠江水产研究所良种基地，F2、F3和F5均来源于珠江水产研究所，农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点开放实验室已保存样本.从选育群体的F2、F3、F5和F6中各随机选择30尾成鱼取尾鳍组织，提取样品基因组DNA(在连续选育过程中，前一世代群体为后一世代群体的亲本).各个位点PCR反应所用的引物均为生工生物工程(上海)股份有限公司产品，并用荧光进行标记(表1).TIANamp Genomic DNA Kit为天根生化科技(北京)有限公司产品.TaqDNA聚合酶，Buffer和dNTP为华美生物工程公司产品.限制性内切酶TaqI、BsrBI和AluI为Fermentas公司产品.

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取按照天根生化科技(北京)有限公司试剂盒说明书提取大口黑鲈鳍条组织的总DNA.8 g/L的琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测DNA质量和浓度，保存于-20℃条件下备用.

1.2.2 PCR扩增在PCR扩增之前，引物用FAM、ROX或HEX荧光来进行标记.PCR反应总体积为20 μL，含有10×Buffer 2.0 μL，MgCl2(25 mmol/L) 0.8 μL;dNTP(10 μmol/L)0.4 μL;上下游引物(20 μmol/L)各0.4 μL;基因组DNA(40 ng)1 μL; dd H2O 15.0 μL，Taq酶(上海申能博彩生物科技有限公司)1 U.PCR扩增程序：94℃预变性4 min;然后94℃变性30 s，48～63℃退火30 s，72℃延伸30 s，32个循环;最后72℃再延伸10 min.

表1 大口黑鲈生长性状相关分子标记引物信息Tab.1 Primers of growth-related markers of largemouth bass

1.2.3 扩增产物检测短串联重复序列(Short tandem repeat，简称STR)基因分型委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成，使用DYY-8型稳压稳流电泳仪(上海琪特分析仪器有限公司)、凝胶成像系统(Gene Genius公司)和3730XL测序列分析仪(美国ABI公司)进行STR序列分析，根据每个扩增条带的相对分子质量的差异性，判断每尾鱼中各个位点的基因型.其中4个微卫星位点和IGF-Ⅰ基因上片段缺失的突变位点直接用STR基因分型技术分析基因型，位于POU1F1、PSSⅢ和MSTN基因上的3个SNP位点分别需要经过限制性内切酶TaqⅠ、BsrBⅠ和AluⅠ酶切后再使用STR基因分型.

1.2.4 统计指标通过STR基因分型技术确定每个个体在各个位点的基因型，计算出每个世代选育群体中每一个位点上的优势基因型的频率(x)和各个选育世代中优势基因型的平均数量和分布.各个世代中优势基因型的数量计算公式：¯x=∑xifi/∑fi.式中，¯x为8个优势基因型的平均数量;xi为第i个优势基因型频率;fi为第i个优势基因型所对应的大口黑鲈检测数量.

2 结果

2.1 优势基因型的分子标记的检测

试验采用STR基因分型技术对大口黑鲈8个生长相关分子标记进行检测，结果显示：随人工选育的推进，F2、F3、F5和F6中，只含有2个优势基因型的分子标记的个体数量逐渐减少，而含有4个优势基因型的分子标记的个体数量逐渐增多(表2).在F2、F3和F5中，每个优势基因型频率的分析结果显示，除PSSⅢ和POU1F1优势基因型的频率有波动之外，其他优势基因型的频率是逐渐升高的(表3).

表2 选育世代中不同优势基因型数量的样本分布Tab.2 The distribution of sample with different dominant genotypes of each generation尾

2.2 优势基因型在各个世代的数量及分布

根据大口黑鲈‘优鲈1号’F2、F3、F5和F6中各个优势基因型的分布进行统计，得到每个世代中8个优势基因型的平均数量.结果显示：‘优鲈1号’F2、F3、F5和F6选育群体中优势基因型的分子标记平均数量依次为2.12、2.70、2.90和3.08，呈现逐代递增趋势，说明人工选育使生长优势基因得到聚合，随着‘优鲈1号’F2、F3、F5和F6生长速度的提高，生长优势标记的平均数量也同步递增.

表3‘优鲈1号’各世代中的优势基因型频率Tab.3The advantage genotype’s frequency in each generation of‘You lu No.1’

3 讨论

3.1 各个优势基因型对生长贡献的差异分析

目前关于不同基因在基因聚合中贡献率的差异报道仍然很少.本研究发现了在基因聚合中对大口黑鲈生长的贡献率较大的生长相关优势基因型.对8个生长相关优势基因型的研究结果显示：位于MSTN基因上的SNP位点和MisaTpw76位点上的优势基因型出现的频率随着‘优鲈1号’生长速度的加快而逐代增大，其余6个优势基因型频率在选育进程中有时增加，有时减小或不变.F2到F3，位于PSSⅢ基因上的SNP位点和JZL60位点的优势基因型频率均未增加，其余位点的优势基因型频率均有所增加;F3到F5，除位于PSSIII基因和POUIFI基因上的SNP位点与JZL60位点的优势基因型频率没有增加之外，其余位点的优势基因型频率都增加;F5到F6，位于IGF-I基因和POUIFI基因上的SNP位点以及MisaT-pw117和JZL67位点的优势基因型频率都下降，其余位点的优势基因型频率均增大.从F2到F6，8个标记中，只有MisaTpw76和位于MSTN基因的SNP位点的优势基因型频率是逐渐上升的，推测这2个标记对生长性状的作用效果比较明显.珠江水产研究所/农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点开放实验室之前的研究结果表明：MisaTpw76位点和位于MSTN基因上的优势基因型的个体分别比其他基因型的个体平均体质量高46.18%［16］和53.24%［15］，其余6个标记中优势基因型群体比自身位点的其他基因型群体的体质量高16.86%～35.84%［13-14，16］，本研究获得的结果与之基本相符.利用8个生长标记来辅助亲鱼挑选时，位于基因MSTN上的SNP和MisaTpw76位点的优势基因型会比其余6个分子标记具有更好的选择效果，应作为今后亲鱼筛选的主要标记，用于大口黑鲈生长性状改良.

3.2 人工选育对优势基因型数量变化的影响

目前，生长性状与生长相关基因聚合的研究大多利用的是2个或3个位点，本文对生长性状与多个生长相关优势基因型间的联系进行探索，试验结果显示：大口黑鲈‘优鲈1号’随着选育世代的累进，优势基因型的平均数量也逐代递增，这种现象与生长速度逐代提高的现象是吻合的，说明传统的以形态和体质量为指标的选育也使优势基因型得到聚合.本研究发现优势基因型的数量从F2到F3、F3到F5、F5到F6(F4保留样品不足，本试验未对其进行分析)的增加幅度依次为：0.58、0.20和0.18，增幅逐渐减小，这与选育群体目标性状逐渐趋向稳定的观测结果相一致.理论上讲，人工选择育种是把某些性状逐渐选留下来，使性状相关的基因型频率增加，随着选育世代的累进，基因的纯合率就会上升，选择的有效度就会下降，对表型和基因型频率的改变幅度都会有所降低［19］，所以优势基因型的数量增幅就会降低.李爱民等［20］对鲁西牛ANGPTL6基因的3个生长相关位点的研究发现，优势基因型数量的增加与生长性状改良是同步的，可以应用于鲁西牛的分子育种实践.赵广泰等［21］对大黄鱼选育世代的研究发现，有2个位点的基因频率随着选育世代的发展呈现有规律的增加，推测这2个位点可能与选育性状存在相关性.本研究也发现，‘优鲈1号’随着选育世代的累进，优势基因型的平均数量是逐渐增加的，推测本研究所选的8个优势基因型在大口黑鲈中所含的数量多少可能与其生长快慢存在相关性.

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【责任编辑柴焰】

Pyramiding of growth-related genotypes in generations of the largemouth bass，Micropterus salmoides，‘Youlu No.1’

XU Lei1，2，BAI Junjie1，LI Shengjie1，SUN Chengfei1
(1 Pearl River Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences/Key Laboratory of Tropical＆Subtropical Fishery Resource Application＆Cultivation，Ministry of Agriculture，Guangzhou 510380，China; 2 College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China)

【Objective】Eight molecular markers related to growth traits were detected in the different breeding populations of largemouth bass，which had been found by previous studies.This would provide useful information for the actual application of limited growth markers in gene pyramiding breeding of largemouth bass.【Method】Using the technology of STR genotyping，genotype of 8 growth markers in the F2，F3，F5 and F6 generations of largemouth bass(Micropterus salmoides)，‘Youlu No.1’were detected and the number of advantage genotypes was analyzed.The growth markers included four sites of single nucleotide polymorphism located inIGF-I，POU1F1，PSSⅢandMSTNgene and four sites of microsatellite：JZL60，JZL67，MisaTpw76 andMisaTpw117.【Result and conclusion】The number of advantage genotypes was 0-6 in the tested fishes.The average number was 2.12，2.70，2.90 and 3.08 in F2，F3，F5 and F6 generations，respectively，presenting an increasing trend with each generation.The number of the advantage genotypes increased synchronously with the growth rate of the breeding large-mouth bass in different populations.This means that the artificial selection has polymerized the advantage genotype to some extent.

advantage genotype;enrichment;STR;genotyping;Micropterus salmoides;breeding

S917

A

1001-411X(2014)01-0007-05

徐磊，白俊杰，李胜杰，等.生长相关优势基因型在大口黑鲈‘优鲈1号’选育世代中的聚合［J］.华南农业大学学报，2014，35(1)：7-11.

2013-03-29优先出版时间：2013-11-07

优先出版网址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.S.20131107.1500.005.html

徐磊(1987—)，男，硕士研究生，E-mail:xlkuaile@126.com;通信作者:白俊杰(1957—)，男，研究员，硕士，E-mail:jjbai@163.net

国家自然科学基金(31201985);公益性行业(农业)科研专项(200903045);国家科技支撑计划(2012BAD26B03)