直接测序法和ARMS法检测非小细胞肺癌表皮生长因子受体基因突变的比较

李辰晨 吴建中 王卓 冯继锋

肺癌是死亡率较高的一种恶性肿瘤，世界范围内每年因肺癌而死亡的人数大约有100万[1]。目前在肺癌的治疗策略方面取得了一定的进步，但患者5年生存率仍然只有15%[2]。随着近几年发现在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）中含有表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）基因突变的比例增高，肺癌的治疗策略也随之发生了巨大变化[3,4]。酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors, TKIs）能够特异性地抑制突变的EGFR蛋白，如吉非替尼和厄洛替尼。

在2011年中国版有关NSCLC的美国国家综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network, NCCN）指南中，根据最新的III期随机研究，如IPASS、First-SIGNAL、WJTOG3405、OPTIMAL治疗，TKIs已作为一线治疗方案，并且EGFR活化突变的存在对一些合适的患者的选择是一个关键的生物学因素[5-11]。因此，在中国很多医院，EGFR突变分析已成为一种常规的分子检测项目。并且直接测序法是最常用的的方法，因为易获得，与实时PCR分析法（如TaqMan探针）、ARMS法和HRM法相比，直接测序法相对价格便宜。

众所周知，肿瘤组织是EGFR突变分析的最佳DNA资源。然而，大多数NSCLC患者处于晚期不能手术，足够的肿瘤组织不易获得。例如，在IPASS研究中，只有36%（437/1,217）患者有组织活检标本适用于检测。在INTEREST研究中，这个比例仅为20%（297/1,466）[5,12]。相反，体液的获取通常很容易，创伤小，且可重复，例如胸水和血浆[13-18]。然而，使用体液的突变的测试程序还需要进行优化、标准化和验证的。

本研究通过直接测序法和扩增阻滞突变系统（amplification refractory mutation system, ARMS）方法（ADx-EGFR 29，厦门艾德公司）来比较不同来源的肿瘤组织标本（包括新鲜组织、石蜡组织及胸水）的EGFR基因中18-21外显子的突变情况。

1 材料和方法

1.1 材料 收集自2012年4月-2013年6月本中心接受进行EGFR基因突变检测的NSCLC患者。这些患者肿瘤组织标本分为新鲜组织、石蜡组织和胸水组织，主要来源于手术切除、穿刺活检以及胸水脱落细胞。

1.2 方法 新鲜及胸水标本先加入裂解液，从400 μL裂解液中用试剂盒（Qia-gen, Hilden, Germany）提取DNA，再用50 μL的蒸馏水洗脱，最后将提取好的DNA放入-20oC冰箱保存备用。提供的石蜡组织，切10张-15张白片，同时染1张HE切片，并在HE切片上标记肿瘤组织区，将白片用无水乙醇浸泡后，对照HE切片刮取收集肿瘤组织，加入裂解液，从400 μL裂解液中用试剂盒（Qia-gen, Hilden, Germany）提取DNA，再用50 μL的蒸馏水洗脱，最后将提取好的DNA放入-20oC冰箱保存备用。通过聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）将EGFR基因中18-21外显子用特异性引物进行扩增。最终的扩展分别用直接测序法和ARMS法来比较两者的测试结果。对于两个方法测试结果不一致的，先进行复测，复测后仍不一致者采用ADX-EGFR试剂盒重新测试。

直接测序法是将提取的产物与特异性引物用ABI PRISM 3730 DNA分析器进行分析测序（应用生物系统，CA，USA）。ARMS法是将患者的DNA用ADx-EGFR突变检测试剂盒检测，该试剂盒利用扩增阻滞突变系统（ARMS）的原理，涵盖了EGFR基因中18-21外显子的29个突变点，包括3种18外显子突变，19种19外显子突变，5种20外显子突变和2种21外显子突变。

1.3 统计学分析 所有统计学检验采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者和样本特征 自2012年4月-2013年6月本中心接受进行EGFR基因突变检测的患者共451例，分别用直接测序法和ARMS法检测。这些患者包括204例男性，247例女性，平均年龄54.8岁±9.5岁，年龄跨度32岁-88岁。新鲜组织包括手术切除、纤维支气管镜活检、肺及淋巴结穿刺的新鲜标本；石蜡组织包括除了胸水之外的病理标本经过处理后的标准FFPE标本；胸水为胸水脱落细胞。有肿瘤组织学分型的患者有406例，其中鳞癌57例，腺癌329例，其他20例。

2.2 直接测序法检测结果 451例患者使用直接测序法检测，其中有182例检测到EGFR基因突变，突变率为40.4%（182/451）；单突变178例，包括18外显子7例，占所有突变的3.9%（7/178）；19外显子99例，占所有突变的55.6%（99/178）；20外显子4例，占所有突变的2.3%（4/178）；21外显子68例，占所有突变的38.2%（68/178），主要是L858R点突变。另外检测到双突变2例，1例为G724S+L858R；1例为S768I+L858R。三突变2例，分别为L730F+S768I+21外显子点突变；19外显子插入突变+S768I+L858R。

图 1 直接测序法检测21外显子L858R点突变Fig 1 Exon 21 L858R point mutation by direct sequencing

图 2 直接测序法检测19外显子缺失突变Fig 2 Exon 19 eletion mutation by direct sequencing

2.3 ARMS法检测结果 451例患者使用ARMS法检测，其中有215例EGFR基因突变，突变率为47.7%（215/451），单突变212例，其中18外显子4例，占所有突变的1.9%（4/212）；19外显子突变117例，占所有突变的55.2%（117/212），主要是缺失突变；20外显子1例，占所有突变的0.5%（1/212）；21外显子90例，占所有突变的42.4%（90/212），主要是L858R点突变。另外检测到双突变3例，为S768I+L858R双突变。

2.4 直接测序法和ARMS法检测结果比较 在该451例两种方法均检测的患者中，两种方法均检测到突变且突变结果一致者127例，结果不一致者5例，均无突变者186例，直接测序法检测到突变而ARMS法未检测到突变者50例，反之83例。50例中有33例为ARMS法29种突变之外的突变。根据表3所示，直接测序法和ARMS法的诊断符合率为70.51%（318/451）。

2.5 不同组织来源检测结果 在该451例患者中，新鲜组织240例，石蜡组织204例，胸水7例。240例新鲜组织中，直接测序法检测到突变者95例，突变率为39.58%（95/240），A R M S法检测到突变者为9 2例，突变率为38.33%（92/240）；两种方法突变率无统计学差异（P=0.083）。在204例石蜡组织标本中，直接测序法检测到突变者85例，突变率为41.67%（85/204），ARMS法检测到突变者为122例，突变率为59.80%（122/204）；两种方法突变率有统计学差异（P＜0.001）。在7例胸水组织中，直接测序法检测到突变者2例，突变率为28.57%（2/7），ARMS法检测到突变者为1例，突变率为14.29%（1/7）；但由于胸水组织标本量过少，不具代表性，在此不进行统计学分析。

3 讨论

在NSCLC的治疗中，分子靶向药物TKIs的应用开启了肺癌治疗的新道路，现可作为一线治疗。TKIs疗效好，针对性强，副作用小，但价格昂贵，对于该药敏感性的检测就是决定是否可以用药的关键。目前公认最有效的预测TKIs疗效的生物标志为EGFR激酶区的突变，EGFR突变与TKIs对于NSCLC患者的治疗效果是紧密联系在一起的，因此临床上需要一种快速、灵敏、准确的检测EGFR突变的方法。

表 1 直接测序法检测出的33例ARMS试剂盒不包括的突变Tab 1 33 mutations by direct sequencing that ARMS kit not include

直接测序法应用PCR直接扩增EGFR基因第18-21外显子的基因片段，目前普遍认为是EGFR基因突变检测的金标准。但其过程比较繁琐，耗时长；对标本所含肿瘤组织的要求比较高，敏感性不低于30%突变拷贝数[19]。测序峰中是否出现了突变波决定了PCR结果的判断，因此，突变波波峰的高低影响判断的结果。在本研究中，对于直接测序法269例未检出突变的患者中，ARMS法多检测出了50例，主要为21外显子突变，该研究表明在直接测序法中，21外显子较其他外显子更易漏检。

表 2 两种方法检测的不一致的突变Tab 2 Inconsistent mutations by the two methods

表 3 直接测序法和ARMS法检测结果比较Tab 3 The comparison between direct suquencing and ARMS

ARMS法是利用Taq DNA聚合酶针对不同的已知突变，设计适当的引物以检测出突变基因。扩增产物通过实时荧光定量PCR技术进行分析。与直接测序法相比，ARMS法敏感度高，为1%[20]，检测起来方便快捷。但ARMS法仅适用于单个已知基因的突变，且由于仪器昂贵限制了临床应用。Kimura等[21]和Horiike等[22]先后报道了ARMS法的高度特异性和灵敏度，但他们仅仅检测了两个最常见的突变位点——第19外显子DelE746-A750和第21外显子L858R，所检测的其他突变类型也较局限，且可能出现漏检。在本研究中，通过直接测序法检测出来ARMS试剂盒29种突变之外的突变为33例，表明ARMS法仅可检测出常见突变，也可能出现漏检。但是对于29种突变之外的突变，是否对TKIs有一定的疗效，还有待进一步的研究。

从不同肿瘤组织的样本取材来看，不同组织对于EGFR突变检测的结果也有一定的影响。许多有关直接测序法和ARMS法检测EGFR基因突变的研究都已表明ARMS法比直接测序法具有更高的特异性和灵敏度。赵婧雅等[23]的研究表明，对于活检小标本而言，ARMS法较直接测序法拥有更高的突变检出率；而对于手术标本无统计学差异。在本研究中，新鲜组织中含有较多的肿瘤组织，因此两者比较无明显统计学差异；而对于肿瘤组织较少的样本，需要较高敏感度，ARMS法则明显优于直接测序法。而对于胸水组织样本的比较以往也有研究，但本例样本量少，不予讨论。因此，可以根据不同组织来源的样本，选择合适的检测方法，从特异性、敏感性、经济快捷各方面取得最优方案。

本研究中也有很多不足之处，在该451例患者中，胸水组织样本过少，不具代表性，不能进行统计学分析。另外，本研究中的ARMS法敏感性较其他研究文献中偏低，原因可能是有相当比例的标本是新鲜组织，标本的一部分用直接测序法检测，一部分用ARMS法检测，检测前并不能确定其中是否含有肿瘤组织，这也就导致两种方法检测的不一致。较理想的做法是经病理确认，同一份DNA分成二份来分别检测。最后，检测的目的是指导靶向药物的治疗，但由于经济等综合原因，只有少数患者在本中心选择靶向治疗，其数据和结果也不具备一定的代表性，在此也未予讨论。

直接测序法和ARMS法检测EGFR基因突变基本一致，ARMS法更为灵敏，且操作方便快捷，但是价格昂贵；对于肿瘤组织含量较少的样本中，ARMS法更为敏感，明显优于直接测序法；直接测序法可以检测到ARMS试剂盒内不包含的少见突变，结合两种方法检测结果更为可靠全面。