异长春花碱逆转肺癌顺铂耐药A549/DDP细胞耐药性的作用和机制

齐春胜 高森 李会强 高卫真

肺癌的治疗是以手术、放疗和化疗为主的综合治疗，化疗通过给予药物以杀死肿瘤细胞，一般与手术和放疗联合使用。顺铂是一种常见的化疗药物，可通过使DNA发生交联，抑制癌细胞的DNA复制和转录，使肿瘤细胞停止生长发生凋亡[1]。但临床实际中，肿瘤细胞往往对化疗药物产生耐受，使治疗失效。因此，查找肿瘤的耐药机制，开发新的逆转耐药性的方法，对提高临床患者的受益有十分重要的意义。目前的研究[2,3]显示，肿瘤细胞产生耐药的机制包括减少药物的吸收，通过转运蛋白增加药物的外排，通过谷胱甘肽系统对抗肿瘤药物进行解毒，凋亡途径异常以减少肿瘤细胞的凋亡等。

异长春花碱（Vinorelbine）是一种新型抗肿瘤药，在一系列临床前研究中发现其可抑制肿瘤细胞的生长，促进细胞凋亡，抑制肿瘤转移[4]。而异长春花碱逆转顺铂耐受肺癌细胞的作用尚未得到充分研究，本研究拟对其作用和分子机制进行初步的探讨。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 人肺癌细胞系A549和A549/DDP购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所；细胞培养基购自Gibco公司；异长春花碱购自Sigma公司；顺铂购自Sigma公司；Rhodamine-123（Rh-123）购自Sigma公司；非放射性细胞增殖检测法（MTS）试剂、real-time PCR试剂盒购自Promega公司；细胞凋亡检测试剂盒购自BD Biosciences；抗MDR1（multidrug resistance protein 1）、Bcl-2、caspase-3/8、survivin、PTEN（Phosphatase and tensin homolog）和p-AKT单抗均购自SantaCruz公司；NF-κB、Twist和Snail的转录活性报告基因检测试剂盒购自Promega；ECL免疫印迹底物试剂盒购自Millipore公司；流式细胞仪CaliburTM：BD公司；酶标仪和PCR仪：Thermo公司。

1.2 细胞培养 A549和A549/DDP培养于10 cm培养皿，37oC、5%CO2和饱和湿度的培养箱中，培养基为90%EMEM，10%胎牛血清（FBS）。0.25%胰酶-EDTA消化传代，所有试验均采用对数生长期细胞。

1.3 MTS法检测异长春花碱对A549细胞的抑制作用 取对数生长期的转染克隆细胞，以（2-3）×104个/mL接种到96孔微孔板中，100 μL/孔，培养过夜使细胞贴壁。向对应试验孔加入0.1 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L异长春花碱，继续培养24 h，吸去培养基，按照试剂盒说明书加入MTS试剂，最后用酶标仪测定490 nm波长下的OD值，并计算药物对细胞的抑制率。抑制率=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。以异长春花碱浓度的对数为横坐标，抑制率为纵坐标作图并拟合抑制曲线，50%抑制率所对应的化合物浓度即为IC50值。

1.4 MTS法检测异长春花碱对A549/DDP细胞耐药性的逆转作用 取对数生长期的转染克隆细胞，以（2-3）×104个/mL接种到96孔微孔板中，100 μL/孔，培养过夜使细胞贴壁。向对应试验孔加入0.1μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L 顺铂和1 μmol/L和5 μmol/L异长春花碱，继续培养72 h，吸去培养基，按照试剂盒说明书加入MTS试剂，最后用酶标仪测定490 nm波长下的OD值，并计算药物对细胞的抑制率。抑制率=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。以异长春花碱浓度的对数为横坐标，抑制率为纵坐标作图并拟合抑制曲线，50%抑制率所对应的化合物浓度即为IC50值。逆转倍数=异长春花碱处理组A549/DDP细胞IC50值/异长春花碱未处理组A549/DDP细胞IC50值。

1.5 流式细胞术检测A549/DDP细胞内Rh-123含量和细胞凋亡 取对数生长期的肿瘤细胞，1 μmol/L和5 μmol/L异长春花碱作用24 h后，加入10 μmol/L Rh-123染液，培养1 h后收集细胞，调整细胞浓度至106/mL，以流式细胞仪检测细胞中Rh-123的荧光强度（488 nm激发光），考察异长春花碱对A549/DDP细胞中Rh-123含量的影响。

取对数生长期的肿瘤细胞，经10 μmol/L顺铂及1 μmol/L和5 μmol/L异长春花碱作用24 h后，加入PI和Annexin V-FITC各20 μL，避光孵育15 min后收集细胞，调整细胞浓度至106/mL，以流式细胞仪检测细胞中PI和FITC的荧光强度（488 nm激发光），考察异长春花碱对A549/DDP细胞凋亡的影响。

1.6 Western blot法检测A549/DDP细胞MDR1、Bcl-2、caspase-3/8、survivin、PTEN和p-AKT蛋白的表达 取对数生长期的肿瘤细胞，1 μmol/L和5 μmol/L异长春花碱作用24 h后，收集细胞并裂解提取蛋白。BCA（bicinchoninic acid）法测定细胞裂解物的蛋白含量，取等量蛋白质以12% SDS-PAGE法分离并转移至醋酸纤维素膜上，以相应的单克隆抗体室温孵育4 h以检测目标蛋白。洗去一抗，以HRP连接的二抗室温孵育2 h，洗涤后以ECL试剂盒显示免疫反应条带。β-actin作为内参。

1.7 Real-time PCR检测A549/DDP细胞中MDR1、Bcl-2、survivin和PTEN的mRNA表达水平 取对数生长期的肿瘤细胞，1 μmol/L和5 μmol/L异长春花碱作用24 h后，用Trizol法提取各组总RNA，用real-time PCR试剂盒进行逆转录得到cDNA。MDR1上游引物序列：5'-AAAAAGATCAACTCGTACCACTC-3'，下游引物序列：5'-GCACAAAATACACCAACAA-3'；Bcl-2上游引物序列：5′-ACGGGGTGAACTGGGGGAGGA-3′，下游引物序列：5′-TGTTTGGGGCAGGCATGTTGACTT-3′；survivin上游引物序列：5′-ACAACCAAACCTCACACTACTG-3′，下游引物序列：5′-ATAGATCCCATTACAGACAGCG-3′；PTEN上游引物序列：5′-CTTTGTGCTGAAAGACATTATGAC-3′，下游引物序列：5′-GGCTTTGTCTTTATTTGCTTTGTC-3′；β-actin上游引物序列：5′-TGAGCGCGGCTACAGCTT-3′，下游引物序列：5′-TCCTTAATGTCACGCACGATTT-3′；94oC变性3 min后，按下述条件扩增40个循环：95oC 5 s，65oC 35 s，72oC 60 s，循环后72oC延伸5 min。

1.8 A549/DDP细胞中NF-κB、Twist和Snail核转录活性的检测 根据试剂说明书的方法，每孔加入0.1 μg的NF-κB、Twist和Snail荧光报告质粒和0.02 μg对照质粒转染细胞，继续培养6 h，洗去未转入细胞的质粒，更换新鲜培养基，加入1 μmol/L和5 μmol/L异长春花碱作用24 h，以Dual-GloTM Luciferase assay system对两种萤光酶的活性进行检测。

1.9 统计学方法 实验数据以均数±标准差表示，使用SPSS 13.0软件进行分析。采用单因素方差分析（One-way ANOVA）进行比较，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 异长春花碱增加A549/DDP细胞对顺铂的敏感性 MTS法检测结果显示，A549/DDP细胞经异长春花碱作用24 h后，细胞抑制率呈现剂量依赖性，1 μmol/L异长春花碱抑制率为3.7%，5 μmol/L异长春花碱抑制率为8.3%，分别为无毒浓度（细胞抑制率＜5%）和低毒浓度（细胞抑制率＜10%），故采用上述两种浓度进行实验（图1）。A549/DDP细胞对顺铂的IC50为60.3 μmol/L，经1 μmol/L和5 μmol/L 异长春花碱作用后，A549/DDP细胞对顺铂的敏感性明显升高，IC50分别为31.6 μmol/L和23.7 μmol/L（图2），逆转倍数（RF）分别为1.91倍和2.54倍（P＜0.05），表明异长春花碱可提高A549/DDP细胞对顺铂的敏感性。

图 1 异长春花碱对A549/DDP细胞增殖的影响Fig 1 The effect of Vinorelbine on A549/DDP cells proliferation.There was an increased cell proliferation inhibition with different concentration of Vinorelbine treatment in A549/DDP cell lines, the IC50 was 35.7 μmol/L. Bars indicate SD, n=5.

图 2 异长春花碱对A549/DDP细胞耐药性的逆转作用Fig 2 Reversal effect of Vinorelbine on A549/DDP cells drug resistance. There was an increased cell proliferation inhibition with 1 μmol/L and 5 μmol/L Vinorelbine treatment in A549/DDP cell lines, the the IC50 of A549 was 9.8 μmol/L, the IC50 of A549/DDP without Vinorelbine treatment was 60.3 μmol/L,IC50 of A549/DDP with 1 μmol/L Vinorelbine treatment was 31.6 μmol/L, IC50 of A549/DDP with 5 μmol/L Vinorelbine treatment was 23.7 μmol/L, the sensitivity of cancer cells to cisplatin was increased by 1.91- and 2.54-folds respectively.Bars indicate SD, n=5.

2.2 异长春花碱提高A549/DDP细胞胞内Rh-123浓度 促进细胞凋亡试验结果显示，1 μmol/L和5 μmol/L异长春花碱作用24 h后，A549/DDP细胞吸收荧光染料Rh-123的能力显著提高，与0 μmol/L组相比，细胞内Rh-123含量分别提高了1.93倍和2.95倍（图3）。进一步的研究发现，1 μmol/L和5 μmol/L异长春花碱作用24 h后，A549/DDP细胞凋亡比例明显上升，与0 μmol/L组凋亡率11.4%相比，细胞凋亡率分别为25.7%和43.6%（图4）。

2.3 异长春花碱调节A549/DDP细胞MDR1、Bcl-2、survivin和caspase-3/8的表达 为研究异长春花碱逆转A549/DDP耐药性，促进凋亡的机制，我们研究了多种耐药基因的表达。结果显示，1 μmol/L和5 μmol/L异长春花碱作用24 h后，MDR1、Bcl-2、survivin和caspase-3/8在蛋白水平的表达均显著下调，MDR1的mRNA表达下调43.5%和25.8%，Bcl-2的mRNA表达下调57.3%和34.1%，survivin的mRNA表达下调37.6%和12.4%（图5）。

2.4 异长春花碱抑制Akt的磷酸化，上调PTEN表达，下调NF-κB、Twist和Snail的转录活性 为研究异长春花碱调节上述耐药和凋亡相关蛋白的机制，我们重点研究了一些关键信号通路的变化。Western blot显示，1 μmol/L和5 μmol/L异长春花碱作用24 h后，肿瘤细胞Akt的磷酸化水平下降，PTEN蛋白表达上调，PTEN的mRNA表达上调183.4%和154.2%，而用报告基因系统评价NF-κB、Twist和Snail这些转录因子的活性时，结果显示，这些因子的转录活性均明显下降，与0 μmol/L组相比，NF-κB转录活性下降53.2%和34.5%，Twist转录活性下降61.4%和33.5%，Snail转录活性下降57.8%和18.7%（图6），说明异长春花碱逆转A549/DDP细胞顺铂耐药性可能通过上调PTEN表达，抑制AKT/NF-κB信号路径活性，进而抑制下游转录因子Twist和Snail转录活性，进一步调节下游基因表达。

图 3 异长春花碱对A549/DDP细胞Rh-123蓄积的影响Fig 3 The effect of Vinorelbine on the intracellular accumulation of Rh-123 in A549/DDP cells. A： The fow cytometry results in the effect of Vinorelbine on intra-cellular Rh-123 content of A549/DDP cells. B： The graph of the effect of Vinorelbine on the mean fluorescence intensity of Rh-123 in A549/DDP cells. The the content of Rh-123 was elevated 1.93- and 2.95-folds with 1 μmol/L and 5 μmol/L Vinorelbine treatment in A549/DDP cell lines compared with 0μmol/L Vinorelbine treatment. Data presented are Mean±SD，bars indicate SD, n=3, *： compared to 0 μmol/L group,P＜0.05.

图 4 异长春花碱对A549/DDP细胞凋亡的影响Fig 4 The effect of Vinorelbine on the apoptosis of A549/DDP cells. A： The fow cytometry results in the effect of Vinorelbine on inducing apoptosis of A549/DDP cells. B： The graph of the effect of Vinorelbine on the cells apoptosis rate of A549/DDP cells. The apoptosis rate was elevated 2.25- and 3.82-folds with 1 μmol/L and 5 μmol/L Vinorelbine treatment in A549/DDP cell lines compared with 0 μmol/L Vinorelbine treatment. Data presented are Mean±SD，bars indicate SD, n=3, *： compared to 0 μmol/L group, P＜0.05.

图 5 异长春花碱对A549/DDP细胞多药耐药基因表达的影响Fig 5 The effect of Vinorelbine on the expression of drug resistance in A549/DDP cells. A： The effect of Vinorelbine on the protein expression of MDR1, Bcl-2, survivin and cleaved caspase-3/8 in A549/DDP cells. There was a downregulated expression of MDR, Bcl-2 and survivin,however, there was an upregulated expression of caspase-3/8 with Vinorelbine treatment. β-actin was as an internal control. B： The effect of Vinorelbine on the mRNA expression of MDR1, Bcl-2 and survivin in A549/DDP cells.Real-time assay showed that the mRNA expression of MDR1 was downregulated 43.5% and 25.8%, Bcl-2 was downregulated 57.3% and 34.1%, survivin was downregulated 37.6% and 12.4% with 1 μmol/L and 5 μmol/L Vinorelbine treatment in A549/DDP cell lines compared with 0 μmol/L Vinorelbine treatment. β-actin was as an internal control. Data presented are Mean±SD，bars indicate SD, n=5, *： compared to 0 μmol/L group, P＜0.05.

图 6 异长春花碱对A549/DDP细胞信号转导路径的影响Fig 6 The effect of Vinorelbine on the signal transduction in A549/DDP cells. A： The effect of Vinorelbine on the expression of p-Akt and PTEN in A549/DDP cells with Vinorelbine treatment. β-actin was as an internal control. B： The effect of Vinorelbine on the mRNA expression of PTEN in A549/DDP cells. The mRNA expression of PTEN was upregulated183.4% and 154.2% with 1 μmol/L and 5 μmol/L Vinorelbine treatment in A549/DDP cell lines compared with 0 μmol/L Vinorelbine treatment. β-actin was as an internal control. Data presented are Mean±SD, bars indicate SD, n=5, *：compared to 0 μmol/L group, P＜0.05. C： The effect of Vinorelbine on the transcriptional activity of NF-κB, Twist and Snail in A549/DDP cells. The transcriptional activities of NF-κB was downregulated 53.2% and 34.5%, Twist was downregulated 61.4% and 33.5%, and Snail was downregulated 57.8% and 18.7% with 1 μmol/L and 5 μmol/L Vinorelbine treatment in A549/DDP cell lines compared with 0 μmol/L Vinorelbine treatment. Data presented are Mean±SD, bars indicate SD, n=5, *： compared to 0μmol/L group, P＜0.05.

3 讨论

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，铂类药物是一类广泛使用的化疗药物，在多种恶性肿瘤的治疗中表现出很好的效果。但肺癌治疗过程中肿瘤细胞发展出来的耐药性，往往导致治疗失败，寻找可运用于临床抵抗耐药性的新药，是提高患者临床受益的迫切需要。

肿瘤细胞对化疗药物产生耐受性的机制之一是过表达MDR1等多药耐药蛋白，增加药物的外排，降低药物在细胞内蓄积和在药靶部位的有效浓度[5-7]。在本研究中，我们发现异长春花碱可增加A549/DDP细胞对顺铂的敏感性，并具有剂量依赖性。我们利用流式细胞术检测了肿瘤细胞对荧光染料Rh-123吸收的变化，结果显示，异长春花碱水平越高，则胞内Rh-123的含量越高。Rh-123是MDR1底物，胞内Rh-123的含量提高可间接说明肿瘤细胞对化疗药物的外排作用降低。进一步的WB和real-time PCR研究显示，MDR1的蛋白和mRNA表达水平均下降，与Rh-123的研究结果一致。

除MDR1以外，凋亡相关基因也可以介导肿瘤细胞对顺铂的耐受。半胱天冬酶8（caspase-8）是细胞凋亡过程中的重要效应物质，激活后可释放到胞质中启动caspase的级联反应，激活下游的半胱天冬酶3（cas-pase-3），导致细胞凋亡。Bcl-2和survivin是肿瘤细胞中重要的凋亡抑制基因，已经被证明在耐药肿瘤细胞中过表达，可通过阻断凋亡终末效应酶caspase-3活性抑制细胞凋亡。本研究的流式细胞分析结果显示，异长春花碱可促进细胞的凋亡，并发现异长春花碱可下调Bcl-2和survivin表达，上调caspase-3/8表达。因此，我们认为异长春花碱是通过下调凋亡抑制基因，上调促凋亡基因表达实现对肿瘤细胞凋亡的调控作用。

PTEN是一种肿瘤抑制基因，可通过抑制Akt磷酸化，下调Akt活性，阻断Akt下游信号转导路径及，调节下游基因表达[8,9]。我们发现异长春花碱可上调PTEN表达，抑制Akt磷酸化和NF-κB转录活性。Twist和Snail是NF-κB的下游靶基因，也是重要的促肿瘤转录因子，可通过调节下游基因在肿瘤耐药产生过程中发挥重要作用，我们的结果也证明长春花碱可下调Twist和Snail的转录活性。

综上所述，我们认为长春花碱逆转A549/DDP顺铂耐药性可能与增加肿瘤细胞药物蓄积，诱导凋亡有关，调节PTEN/AKT/NF-κB信号路径活性，进而调节下游Twist和Snail等转录因子活性和耐药相关基因表达，可能是其作用机制的中心环节。