白毛七活血化瘀作用有效部位的筛选＊

薛瑞 孙静 刘洁琼 宁夏药品检验所（银川 750004）

白毛七来源于金粟兰科植物银线草（Chloranthus japonicus sieb）、多穗金粟兰（Chloranthus multistachys Pei）、宽叶金粟兰（Chloranthus henryi Hemsl）以及丝穗金粟兰（Chloranthus fortune Solms）的干燥根及根茎，全株供药用，具有祛湿散寒、活血止痛、散瘀解毒的功效[1]。金粟兰属植物在我国主要分布在东北、河北、山西、陕西、甘肃等省区[2]。银线草为白毛七主要药源之一，早在民间就有广泛的应用，全草根茎可供药用，如《陕西中草药》记载银线草：“祛湿散寒，理气活血，散疲解毒。主治劳伤，腰腿疼，跌打损伤，感冒等”，《长白山药用植物志》记载：“主治风寒咳嗽，无名肿毒，皮肤瘙痒”等等[3]。但有关该药材在活血化瘀作用及其有效部位的研究领域为空白，植物开发应用方面很成功，但其基础研究薄弱，有效成分不清楚，作用机理不明确。为了明确白毛七活血化瘀的作用，为临床提供实验依据，本研究对其活血化瘀作用及有效部位进行比较研究。

1 材料和方法

1.1 动 物 SPF级SD大鼠，雄性，体重180g±20g；SPF级昆明小鼠，20±2g，雌雄各半，由西安交通大学动物实验中心提供，动物生产许可证号：SCXK（陕）2007-001。

1.2 药物和试剂

1.2.1 药材：白毛七药材购自秦岭太白县，经本院王继涛教授鉴定为该药材来源于金粟兰科（Chloranthaceae）植物银线草（Chloranthus japonicus sieb）干燥根及根茎。

1.2.2 水提物：称取白毛七药材20g，12倍量水浸泡30min，回流提取3次，每次2h，合并提取液浓缩，分别配成分别配成原药材含量为0.2g／mL（小鼠剂量）和1.0g／mL（大鼠剂量）的溶液。

1.2.3 醇提物：称取白毛七药材20g，12倍量70%乙醇浸泡30min，加热回流提取3次，每次2h，合并提取液回收乙醇只无醇味，加少量水，分别配成分别配成原药材含量为0.2g／mL（小鼠剂量）和1.0g／mL（大鼠剂量）的溶液。

1.2.4 系统溶剂法各提取物：称取白毛七药材100g，依次用8倍量石油醚，氯仿，乙酸乙酯，正丁醇提取，提取3次，每次2h，合并各部位提取液，回收溶剂浓缩，加适量0.5%CMC-Na蒸馏水溶液研磨配置成混悬液，分别配成原药材含量为0.2g／mL（小鼠剂量）和1.0g／mL（大鼠剂量）的溶液。记作石油醚提取部位、氯仿提取部位、乙酸乙酯提取部位和正丁醇提取部位。

1.2.5 主要试剂：银杏叶片（江苏晨牌药业有限公司，批号110101），使用时取银杏叶片适量，研成粉状，用80%乙醇溶液超声提取2次，每次30min，浓缩，加入适量蒸馏水，分别配成原药含量为0.125片／mL（小鼠剂量）和0.046片／mL（大鼠剂量）的溶液。盐酸肾上腺素（上海合丰制药有限公司，批号101201）。乌拉坦。凝血酶原时间（PT）测定试剂盒（上海太阳生物技术有限公司，批号202106）。所用试剂均为分析纯。

1.3 仪 器 YLS-14B动物血栓生成仪（山东省医学科学院设备站）；AR-1140型电子天平（梅特勒－托利多（上海）有限公司制造）；KH-400KDE超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）。

1.4 试验方法

1.4.1 小鼠出、凝血时间及凝血酶原时间的测定[4－7]：取80只小鼠，体重20±2g，雌雄各半，随机分为8组，每组10只。分别记为醇提组、水提组、石油醚组、氯仿组、乙酸乙酯组、正丁醇组、阳性组和空白组。适应性饲养5d后，除空白组和模型组灌等体积生理盐水，其余每组按0.4mL／d／只进行灌胃给药，连续给药7d。末次给药后1h后，用手术剪于尾尖1.5mm处剪断尾，待血液自行溢出开始计时，每间隔30s用滤纸吸去血滴1次，直至血流自然停止，记为出血时间。小鼠摘眼球取血，置于含有0.109mol／L枸橼酸钠抗凝液的子弹头中，轻轻点到混匀，3000rpm离心15min，收集上层液，取待测血浆0.1mL，37℃孵育3min，加入37℃预温PT试剂0.2mL，轻轻振摇，并对光观察，测定出现果冻样状态的时间，记为凝血酶原时间。同时取一滴血，使血滴于玻片上，立即按下秒表计时，每隔20～30s用针头挑血一次，直至出现丝状血块，停表记录为凝血时间。

1.4.2 大鼠凝血时间和血栓的测定[8－9]：取雄性SD大鼠50只，体重200±20g，按体重随机分为5组，每组10只，记为正丁醇组、乙酸乙酯组、阳性组、模型组和空白组。适应性饲养5d后，除空白组和阳性组灌等体积生理盐水，其余组均按4mL／d／只剂量进行灌胃给药，连续灌胃给药7d后禁食不禁水12h，第8d除空白组外，其余各组大鼠皮下注射盐酸肾上腺素（Adr）（10μg／mL）两次0.08mL／100g，间隔4h，在两次注射Adr之间将大鼠浸入冰水内5min，造成急性血瘀模型。造模后，大鼠颈总动脉取血，当血液自行流出后，将血滴滴于载玻片，立即开始计时，伺候每隔5～10s用干燥的针头挑动血滴1次，至针头挑起纤维蛋白丝为止，即为凝血时间。大鼠颈总动脉取血，让血液直接流入人造血管里，人造血管两接头插紧，放入仪器内，启动开关，10mins，37℃条件下，一起报警声响后去出，将人造血管里的血均匀导在滤纸上，称重，1d后，再称量血栓干重。

2 实验结果

2.1 小鼠出、凝血时间及凝血酶原时间 结果见表1，显示醇提部位和正丁醇部位能显著延长小鼠凝血时间，乙酸乙酯提取部位有一定延长小鼠凝血时间的作用。

实验结果表明，阳性组和空白组对照组均有极显著性差异（P＜0.01）。各提取部位与空白组比较，正丁醇提取部位能显著延长小鼠的凝血时间和出血时间（P＜0.05），乙酸乙酯提取部位有显著延长小鼠凝血时间的作用，醇提部位和正丁醇提取物能明显延长小鼠的凝血时间（P＜0.05），且正丁醇部位效果优于醇提部位活血作用。水提部位、石油醚部位和氯仿提取部位与空白对照组比较均无显著性差异，可判断该部位没有活血化瘀的作用，且白毛七活血化瘀物质极性偏小，易溶于有机溶剂。

表1 各提取部位对小鼠凝血时间、出血时间和凝血酶原时间的影响（，n＝10）

表1 各提取部位对小鼠凝血时间、出血时间和凝血酶原时间的影响（，n＝10）

注：与空白组比较△P＜0.05，▲P＜0.01

分组 凝血时间（s） 出血时间（min） 凝血酶原时间（s）132±26.09 10.73±1.78 11.41±0.65阳性组 198±25.97▲ 14.10±1.93▲ 12.91±0.94▲水提组 143±29.01 11.86±1.75 11.10±0.82醇提组 165±21.89▲ 12.45±1.47△ 12.07±0.63△石油醚组 137±29.29 11.32±1.42 11.09±0.59氯仿 144±25.25 11.87±1.41 10.79±0.86乙酸乙酯组 167±32.43△ 12.17±1.72 11.06±0.82正丁醇组 163±15.26△ 12.75±1.11▲ 12.28±0.99空白组△

2.2 大鼠凝血时间和抗血栓形成实验 结果见表2，显示正丁醇部位有显著的抗血栓形成的作用。

表2 各提取部位对大鼠活血化瘀作用的影响（，n＝10）

表2 各提取部位对大鼠活血化瘀作用的影响（，n＝10）

注：与空白组比较△P＜0.01，与模型组比较▲P＜0.01

分组 凝血时间（s） 血栓湿重－干重（g）18.2±1.69 1.1107±0.0342模型组 14.7±2.54△ 1.3014±0.6622△阳性组 22.2±4.87▲ 1.0646±0.0385▲正丁醇组 20.9±2.60▲ 1.0829±0.8111▲乙酸乙酯组空白组17.2±7.65 1.19241±0.0849

实验结果表明，模型组指标与空白对照组有极显著性差异（P＜0.01），表明盐酸肾上腺素和冰水刺激引起的寒凝血瘀证大鼠模型建立成功。与模型组比较，正丁醇提取物能显著延长急性血瘀模型大鼠的凝血时间，有明显抗血栓形成的作用（P＜0.01），乙酸乙酯提取物与模型组比较无显著性差异。

3 讨 论 血液流变学在宏观上是研究血液与血浆的流变性质，比如血液粘度、血浆粘度与剪切率的关系，凝血与血栓形成等[10]。而在中医药的使用历史上，活血化瘀中药主要具有改变血液流变学、血流动力学、血小板功能、调节血脂以及抗凝血等作用。

考虑实验成本等因素，本实验通过采用系统溶剂法，先以小鼠出血、凝血时间和凝血酶原时间为考察指标，初步筛选出白毛七具有活血化瘀作用的部位，再根据试验结果，以大鼠凝血时间及体外血栓质量为考察指标，进一步筛选白毛七活血化瘀有效部位，结果显示正丁醇提取部位有抗血栓形成的作用，因此初步可认为正丁醇部位所含的主要成分是白毛七活血化瘀的主要有效成分。但白毛七正丁醇提取部位的有效成分还有待进一步研究。

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