HPLC法同时测定偏瘫口服液中阿魏酸与丹酚酸B的含量

广西壮族自治区柳州食品药品检验所，广西 柳州 545006

HPLC法同时测定偏瘫口服液中阿魏酸与丹酚酸B的含量

蒋秋香吴柳春韦永朴

广西壮族自治区柳州食品药品检验所，广西 柳州 545006

目的利用双波长高效液相色谱法，建立偏瘫口服液中阿魏酸、丹酚酸B的含量测定方法。方法采用双波长HPLC法，Waters SunFire C18(4.6mm(250mm，5μm)色谱柱，柱温35℃；甲醇-0.1%磷酸溶液为流动相，以1.0mL·min-1流速梯度洗脱；阿魏酸检测波长为318nm、丹酚酸B检测波长为286nm。结果：根据回归方程，阿魏酸和丹酚酸B的线性范围分别为6.152～76.9μg(r=0.9998)、294.8～3685.0μg(r=1.0000)；加样回收率分别为99.7%(n=6)、 98.2%(n=6)。结论：本方法操作简单，结果准确，重复性好，可有效地提高该制剂的内在质量，也为该药品标准进一步研究，提供一个准确的参考方法。

HPLC；梯度洗脱法；偏瘫口服液；阿魏酸；丹酚酸B

偏瘫口服液由地龙、丹参、红花、川芎、王不留行和甘草六味中药组成，具有活血、驱风通络的作用，是广西柳州市中医院用于治疗偏瘫的常用院内制剂。现行质量标准比较简单，仅检查药品性状、鉴别、相对密度及pH值等，无含量测定项目。方中丹参和川芎属活血化瘀药，丹参具有活血祛瘀，养血安神，凉血消肿的功效[1]，现代药理研究其具有抗血栓、改善微循环、促进组织的修复与再生等作用[2]；川芎具有活血行气、祛风止痛的功效[1]，现代药理研究其具有扩张血管、抗血栓、改善微循环等作用[3]。为此，以方中丹参有效成分丹酚酸B、川芎有效成分阿魏酸为指标成分，针对其不同的化学结构，首次采用多波长高效液相色谱法，同时检测阿魏酸、丹酚酸B的含量。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters 2695型高效液相色谱仪，2487型紫外检测器，Empower Pro工作站(Waters公司)；UV-2450紫外分光光度计(日本岛津公司)；METTLER XS205电子分析天平(瑞士梅特勒公司)。

1.2 试药 对照品阿魏酸(批号：110773-200611)、丹酚酸B(批号：110861-200808)购自中国药品生物制品检定所。甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。偏瘫口服液样品3批(规格为10ml/瓶，批号20101129；20101223；20110228)，由广西柳州市中医院制剂室提供，阴性样品按偏瘫口服液处方比例自配。

2 实验方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Waters SunFire C18(4.6 mm(250 mm，5 μm)，柱温35℃；以甲醇(A)和0.1%磷酸溶液(B)为流动相，梯度洗脱。0～22min甲醇的比例为30%；22～25min甲醇的比例为30%～40%；25～53min甲醇的比例为40%。流速1.0ml·min-1；阿魏酸检、丹酚酸B检测波长为分别318nm(0～30min)、286nm(30～53min)；进样量为10μl。按上述实验条件进行测定，结果理论板数以2种指标成分(阿魏酸、丹酚酸B)计均不低于5000，且2种成分都能达到基线分离，分离度大于1.5。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液制备 分别取对照品阿魏酸、丹酚酸B适量，精密称定，加甲醇制成含阿魏酸0.003mg·ml-1、丹酚酸B 0.15mg·ml-1的混合溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液 取偏瘫口服液样品过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性供试品溶液 取缺川芎的阴性样品和缺丹参的阴性样品，分别过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.3 专属性试验 分别取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性供试品溶液各10μl，按上述色谱条件进样，液相色谱图见图1。阴性样品在阿魏酸、丹酚酸B的色谱峰位置上无吸收，表明该方法的专属性良好。

2.4 线性关系考察 分别精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液2、5、10、15、20、25μL进样分析，记录峰面积。以峰面积Y对进样量X(μg)进行线性回归，求得阿魏酸和丹酚酸B标准曲线的回归方程、相关系数，结果见表1。

表1 阿魏酸和丹酚酸B的回归方程、相关系数和线性范围

2.5 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液，连续进样6次，每次10μl，以阿魏酸、丹酚酸B峰面积计，RSD分别为0.9%，1.5%。表明该方法精密度良好。

2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，室温下分别于0、2、8、12、20、24h进样测定，考察阿魏酸、丹酚酸B在室温下的溶液稳定性，记录色谱图，以峰面积进行计算，结果RSD分别为1.0%、2.2%。表明供试品溶液室温放置24h内保持稳定。

2.7 重复性试验 取同一样品各6份，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，进样10μl，测定。结果样品中阿魏酸和丹酚酸B平均含量(n=6)分别为2.635μg·ml-1，128.8μg·ml-1；RSD分别为1.2%，1.5%。表明该方法重复性良好。

2.8 回收率试验 精密吸取“2.7”项下已知阿魏酸、丹酚酸B含量的样品5ml共6份，分别精密加入“2.2.1项下的对照品混合溶液(阿魏酸3.076μg·ml-1、丹酚酸B147.4μg·ml-1)5ml，按“2.2.2”项下方法操作，制备供试溶液，测定，计算回收率。结果阿魏酸和丹酚酸B的平均回收率(n=6)分别为99.7%(RSD=1.6%)，98.2%(RSD=0.9%)。

2.9 样品含量测定 分别取3个批号的偏瘫口服液样品，按“2.2.2”项下制备供试品溶液。精密吸取供试品溶液及混合对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，进行测定，按外标法计算含量，结果见表2。

表2 偏瘫口服液中阿魏酸和丹酚酸B的含量(μg·ml-1)

4 讨论

4.1 检测波长的选择 经紫外分光光度计扫描波长，阿魏酸、丹酚酸B分别在318nm、286nm处有最大吸收，与2010年版中国药典一部川芎(阿魏酸)、丹参(丹酚酸B)的含量测定检测波长分别为321nm、286nm相符合。在试验中选择同时兼顾到2个被测成分在某单一波长下检测，结果大大降低了被测成分的检测灵敏度，甚至造成被测成分未检出的后果。故本文采用多波长测定法，分别在各被测成分紫外最大吸收波长处同时进行含量检测。这样既提高了检测灵敏度，又为测定结果准确可靠提供保障。

4.2 流动相的选择 参考中国药典及文献资料[4-5]，综合几种流动相方法分析，得出本实验流动相条件。结果表明采用本实验所采用的梯度洗脱方法，能较好的分离有效成分，且分离时间短，峰形好。

4.3 供试品溶液的制备 样品无需任何前处理，直接过滤膜即可进样分析。既操作简便，利于生产厂家半成品及成品快速检测，又消除了分析环节的一大误差因素。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M]：2010年版一部.北京：中国医药科技出版社，2010.

[2] 罗彩莲.丹参的药理作用与临床应用[J].中国当代医药，2012，19(12)：11-12.

[3] 裴艳霞.川芎的药理作用及临床应用[J].中国医药指南，2011，9(34)：197-198.

[4] 刘建明，郭咏梅，周娟丽.HPLC法测定新生化颗粒中阿魏酸的含量[J].宜春学院学报，2012，3(4)：111-112.

[5] 于晶晶，徐飞鹤.RP-HPLC同时测定香丹注射液中丹参素钠、原儿茶醛和丹酚酸B的含量[J].海峡药学，2012，2(2)：45-47.

HPLCwithdual-wavelengthsimultaneousdeterminationoftwoeffectiveingredientsinPiantanoralliquidbygradientelution

JIANG Qiu-xiang WU Liu-chun Wei Yong-pu

Guangxi Liuzhou Institate for Food and Drug Control,Liuzhou 545006,China

To establish an HPLC with dual-wavelength detection method for simultaneous determination of Ferulic acid and Salvianolic acid B in Piantan oral liquid.MethodsThe quantitative analysis was carried out on a column of Waters SunFire C18(4.6 mm×250 mm,5 μm) by HPLC with dual-wavelength , by a gradient elution using methanol(A) and water(B) as mobile phase at a flow rate of 1.0 mL·min-1at 35 ℃;The eluate was detected by multiple wavelength: 318 nm for Ferulic acid (0～30min),286 nm for Salvianolic acid B (30～50 min).ResultsThe linear ranges of Ferulic acid and Salvianolic acid B fell within the ranges of 6.152～76.9μg(r=0.9998) and 294.8～3685.0μg(r=1.0000); The average recoveries were 99.7%(n=6) for Ferulic acid and 98.2%( n=6) for Salvianolic acid B.ConclusionThis method is simple, accurate, reliable and can be use to improve inner quality,also provides a reference standard for the quality control of Piantan oral liquid.

Piantan oral liquid; Ferulic acid; Salvianolic acid B

蒋秋香(1983-) 女，汉族，广西全州人 ，主管中药师，主要从事药品、食品、化妆品、保健食品的检验和标准研究。E-mail：67370082@QQ.com

R284.1

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1007-8517(2014)01-0007-03

2013.11.15)