诱导调节T细胞的鉴别及生成

黄尚 朱同玉 戎瑞明

(复旦大学附属中山医院泌尿外科，上海 200032)

1 引言

调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)在器官移植免疫中起着重要的免疫抑制作用。Treg分为胸腺自然发育的自然调节T细胞(natural Treg,nTreg)和在外周免疫器官中经诱导产生的诱导调节T细胞(induced Treg,iTreg)。这两种Treg都可对免疫活动起抑制作用，但二者作用不完全一致。nTreg主要负责内源性抗原耐受[1-2]，而iTreg主要负责外源性抗原耐受[3-5]。因此，鉴别这两种Treg以及诱导可致外源性抗原耐受的iTreg具有重要的临床意义。

2 nTreg及iTreg的鉴别

2.1 nTreg和iTreg的功能区分 iTreg及其前体普通T细胞(conventional T cell,Tconv)的T细胞受体(T cell receptor,TCR)库主要负责识别外源性抗原[3,6-7]。在小鼠模型和人群中iTreg功能下降均可导致外源性抗原耐受下降和炎症性肠炎的发生[4,8]。Xu等[5]研究发现，输注iTreg可降低气道高反应性，抑制嗜酸性粒细胞聚集，降低IgE水平，减轻哮喘模型的炎性反应。肾移植患者的CD4+CD25+Foxp3+IFNγ+的iTreg与移植肾长期存活率相关[9]。因此，iTreg在功能上倾向于抑制外源性抗原产生的免疫反应。

2.2 nTreg和iTreg的研究模型 目前尚无理想的用于鉴别nTreg和iTreg的分子标志物。因此，对这两个细胞亚群的功能研究一般应用因抗原编码基因缺陷而不能产生成熟T淋巴细胞和B淋巴细胞的Rag-/-小鼠[10]，将特异的抗原基因转入该种小鼠体内以产生抗原特异性的单克隆iTreg或是将体外培养的nTreg或iTreg输入体内[1,11]；也可采用无法产生iTreg的CNS1-/-小鼠与野生型或经其他处理小鼠对照，研究iTreg的功能[1,12]。

2.3 nTreg和iTreg的分子标志物

2.3.1 Helios Helios是Ikaros转录因子家族中的一员。Ikaros家族在淋巴细胞的生成、活化及稳态维持中起重要作用[13]。Thornton等[14]曾发现，Helios是nTreg的特异性标志物。然而，近年来，不支持该结论的证据也有很多，例如Verhagen等[15]研究中的Rag-/- Tg4转基因小鼠无法产生nTreg，其Treg理论上应该均为Helios-，但给予外源性抗原刺激后，该小鼠外周Helios+Treg占Treg总数的50％～60％；Gottschalk等[16]在体内和体外实验中也发现，iTreg可表达Helios；Zabransky等[17]亦发现，Helios是否表达与Treg是否来源于外周无关，而Treg的调节活性与Helios+Treg的绝对数量呈正比。由此可见，Helios可能是Treg行使功能的标志物，而非nTreg的特有标志物。目前对Helios的功能争议很大，但得到公认的是Helios+Treg在Treg群体中具有特殊的功能和地位，因此，对于Helios的具体作用还需要深入研究。

2.3.2 Neuropilin-1 Neuropilin-1(Nrp-1)表达于淋巴细胞、神经元细胞及肿瘤细胞表面，曾被作为区分Treg和Tconv的标志物[18]。近年来，Weiss等[19]和Yadav等[20]的研究发现，Nrp-1在nTreg中高表达，而iTreg低表达或不表达Nrp-1。Nrp-1作为分子标志物的最大优势在于它表达于细胞表面，故便于Nrp-1+Treg的分离、纯化。但是，Weiss等[19]在小鼠实验性变态反应性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)和肺炎模型中均发现Nrp-1- iTreg可转换为Nrp-1+iTreg的现象，因此，免疫微环境对Nrp-1的表达可能也有影响。

对于Helios作为nTreg的标志物争议很大，而Nrp-1在炎性反应环境中又可在iTreg中表达，因此，这两种分子的表达、功能和分布仍需深入研究，同时仍有待寻找新的nTreg或iTreg标志物。

2.4 基因表达 nTreg和Tconv表达的基因不尽相同，例如，Itgae、Nrp1等基因由nTreg所特有[21]。口服免疫原可刺激Tconv表达Foxp3等Treg必须的基因，从而使Tconv转化为iTreg并行使调节功能。iTreg中某些和调节功能无关的基因的表达程度更接近其前体Tconv而非nTreg，例如Igfbp4和Dapl1基因在nTreg及其前体细胞均低表达或不表达，而在Tconv及iTreg均高表达，甚至在Nrp-1+iTreg中Dapl1也高表达，说明其表达较稳定[19]。因此，Tconv和iTreg均表达而nTreg不表达的基因及其产物有望成为区分iTreg和nTreg的较好的分子标志物，有待深入研究。

3 iTreg生成的诱导

免疫复合物、共刺激信号、细胞因子等作用均与iTreg的增殖有关，传染耐受(infectious tolerance)机制也可能与iTreg的诱导产生有关。

3.1 影响iTreg生成的因素

3.1.1 免疫复合物及共刺激因子 诱导iTreg生成的条件与nTreg有许多不同。弱抗原刺激产生的iTreg会被诱导凋亡，而低剂量强抗原刺激产生的iTreg可持续在外周行使功能，低TCR-pMHC免疫复合物刺激强度和一定的持续时间均是有利于iTreg在体内生成的因素[22]。CD28是抗原信号传递的重要共刺激因子，体外和体内研究[23]发现，CD28共刺激强度与iTreg生成负相关，强烈的CD28共刺激信号可抑制iTreg产生，且CD28共刺激强度是影响iTreg生成的一个独立因素。细胞毒淋巴细胞相关抗原-4(cytotoxic T lymphocyte antigen-4，CTLA-4)是T细胞活化的重要负性共刺激因子。体外研究[24]发现，CTLA-4-/-小鼠的CD4+CD25- T细胞无法被诱导表达Foxp3而转化为iTreg，在野生型CD4+CD25- T细胞中使用抗体阻断CTLA-4也可抑制TGF-β对Foxp3+iTreg的诱导作用。

除了CD28和CTLA-4，程序性死亡受体配体-1(programmed cell death ligand 1,PD-L1)等分子也可作为共刺激因子发挥作用。在体外，使用PD-L1包被磁珠可诱导iTreg的免疫调节功能，且PD-L1-/- APC无法使幼稚CD4+T细胞转化为iTreg；在体内，PD-L1-/-小鼠的iTreg生成明显受到抑制[25]。补体片段C3a和C5a的受体C3aR和C5aR可提供效应T细胞的共刺激信号，维持其生存和促进活化。然而，在Treg细胞中，不管体外还是体内，无论是在蛋白层面或基因层面，阻断C3aR和C5aR的信号转导都可抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路，从而诱导Foxp3的表达而促进iTreg生成[26]。

3.1.2 细胞因子 IL-2是诱导iTreg生成的重要细胞因子。在体外和体内，IL-2需要TGF-β共同作用才能使CD4+CD25- T细胞转化为CD4+CD25+T细胞而生成iTreg[27]。实验和数学建模分析显示，iTreg只能利用周围约10μm 范围内的IL-2，而iTreg本身并不分泌IL-2，这可能是限制iTreg在体内产生的因素之一[28-29]。除了IL-2，TGF-β也是诱导iTreg必不可少的细胞因子。TGF-β可增强活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells，NFAT)和Smad3与保守非编码序列-1(conserved non-coding sequence-1,CNS-1)增强子的结合，增强CNS-1 DNA组氨酸的乙酰化，经过一系列步骤诱导Foxp3的表达[30]。体外诱导的iTreg并不稳定，Selvaraj等[31]对TGF-β和iTreg的作用进行了动力学分析，结果发现，虽然TGF-β可将约90％的幼稚T细胞诱导为iTreg，但培养体系中去除TGF-β后4 d即可观察到Foxp3表达下降。

3.2 iTreg与传染耐受 传染耐受是指，在抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APC)的辅助下，已有的Treg可将幼稚T细胞转化成iTreg。此过程综合了有利于iTreg生成的各项因素，指明iTreg的来源即幼稚T细胞，提供了在体内不断生成iTreg的可能性。

Cobbold等[32]提出了传染耐受机制的模型(图1)。在这个模型中，APC和Treg将幼稚T细胞转化为iTreg的过程发生在微观的免疫微环境中，Treg表面的IL-10、TGF-β等细胞因子和CTLA-4等抑制性共刺激信号由Treg提供，上调APC的必需氨基酸(essential amino acid,EAA)代谢酶，使微环境中的色氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、组氨酸等EAA减少，从而通过mTOR信号通路抑制幼稚T细胞向效应性T细胞分化。与此同时，Treg和APC在TGF-β的作用下分别表达CD39和CD73，将ATP降解为腺苷。在TGF-β、腺苷、ATRA和mTOR信号通路的共同作用下，幼稚T细胞即可转化为iTreg。

图1 传染耐受的发生过程，引自文献[32]

EAA对幼稚T细胞分化方向的影响已成为免疫代谢研究内容的一部分。当免疫微环境中有足够氨基酸、糖、脂质等营养物质时，幼稚T细胞倾向于启动PI3K/AKT/mTOR通路，以有氧糖酵解供能分化为效应性T细胞[33]；而当这些营养物质不足时，幼稚T细胞则倾向于启动LKB1/AMPK通路，以氧化磷酸化供能分化为Treg[34]。传染耐受模型将各种细胞因子、共刺激因子、APC、腺苷、ATRA等一系列已被证明可调节iTreg生成的因素综合起来，与最近流行的免疫代谢学说也有很大的交集。研究传染耐受的调控可能对免疫调节的临床应用开拓新的思路，值得进一步研究。

4 结 论

尽管iTreg的研究取得了很多进展，但仍有很多关键问题尚待解决，包括寻找iTreg特异的表面标志物或表面标志物集合、iTreg在免疫稳态和免疫耐受中的作用范围、利用传染耐受有效地在体内诱导大量特异性或非特异性iTreg生成、增强iTreg在体内的稳定性以及iTreg的临床应用等。

iTreg细胞的最终应用目的是维持正常人的免疫稳态或者诱导移植患者的免疫耐受。过多CD4+效应性T细胞可破坏免疫稳态，诱发自身免疫性疾病，在移植患者中产生移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)或排斥移植器官；而过多CD4+调节性T细胞会限制免疫系统对外来病原体的正常防御作用和对肿瘤的免疫监视作用[35]。因此，只有对iTreg进行深入研究，才可能使其安全有效地早日应用于临床。

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