染料木素对AD大鼠海马CaM-CREB信号转导通路相关蛋白的影响

鲍 鑫 ，蔡 标 ，2，王 艳 ，2，梁 杰 ，李珊珊

（1.安徽中医药大学，安徽合肥230038； 2.安徽省中医药科学院，安徽合肥230038）

目前，中国已进入老龄化社会，阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）的高发病率已引起医学界的高度关注，它是一种进行性神经退行性疾病。染料木素（Genistein，GS）是大豆异黄酮最主要活性成分，与人类雌激素结构相似，与雌激素受体（ER）特别是雌激素受体β（ERβ）有较高的亲和力，具有弱雌激素样作用［1-3］。因此，GS成为雌激素的天然替代品。相关研究表明，GS能使海马和皮质神经凋亡的数量减少，对体外培养的皮层和海马神经元起到保护作用［4］，在防治AD中能通过对抗β淀粉样蛋白的毒性保护神经［5］。本实验通过观察染料木素对AD大鼠学习记忆能力的影响和海马组织形态学变化，检测AD大鼠海马组织钙调蛋白（calmodulin，CaM）含量、海马组织环腺苷酸反应元件结合蛋白（cAMP response element-binding protein，CREB）、磷酸化 CREB（p-CREB）的表达，研究染料木素对阿尔茨海默病大鼠海马CaM-CREB信号转导通路的影响，探讨染料木素预防AD、改善学习记忆功能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 选用安徽医科大学实验动物中心提供的体重250 g～350 g的10月龄SD雌性大鼠120只［清洁级，合格证SXCK（皖）2011-002］。自由摄食与饮水。

1.1.2 药物与试剂 染料木素（纯度90%，Sigma公司提供，批号110223）；羧甲基纤维素钠（国药集团化学试剂有限公司提供，批号 F20101221）；Aβ25～35（Sigma公司提供，批号108K4794）；戊酸雌二醇片（Estradiol Valerate，EV）（DELPHARM Lille S.A.S 公司提供，批号142A）；CaM测定试剂盒（上海活乐生物科技有限公司，批号 20110569）；CREB（一抗，美国Stancruz公司提供，批号BS1624）；p-CREBS133（一抗，美国Stancruz公司提供，批号BS4053）；二抗试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号812251A）。

1.1.3 实验仪器 双臂数字式脑立体定位仪（美国stoelting产品）；RWD-202微量注射泵（深圳瑞沃德生命科技有限公司产品）；722N型分光光度计（上海精密科学仪器有限公司产品）；Multiskan MK2型酶标仪（Labsystem产品）；Wellwash 4 MK2型洗板机（Labsystem产品）；移液器（Eppendorf产品）；BX51型光学显微镜（日本OLYMPUS产品）；JEDA 801D图像采集处理系统（江苏捷达产品）。

1.2 实验方法

1.2.1 分组与给药 将120大鼠随机分为空白组（Blank）、模型组（OVX）、染料木素高剂量组（GS-H，90 mg/kg）、染料木素中剂量组（GS-M，30 mg/kg）、染料木素低剂量组（GS-L，10 mg/kg）、雌激素阳性对照组（戊酸雌二醇组，EV，0.4 mg/kg）6组，每组20只。预先给药7 d后，以D-半乳糖联合Aβ25～35诱导制备AD大鼠模型［6］，连续28 d。用0.5%羧甲基纤维素钠将染料木素分别配成浓度为9 mg/mL（GS-H组）、3 mg/mL（GS-M组）、1 mg/mL（GS-L组）的混悬液，蒸馏水加戊酸雌二醇配制成浓度为0.04 mg/mL的溶液。每组每天灌胃给予相应的药物（1 mL/100 g），模型组给予等量的0.5%羧甲基纤维素钠。空白组正常喂养。

1.2.2 造模 大鼠经腹腔注射10%水合氯醛380 mg/kg麻醉后，固定于脑立体定位仪上。无菌条件下操作，沿头顶部正中线1 cm纵向切口，暴露前囟，参照大鼠脑立体定位图谱，以前囟为原点，旁2.2 cm，后4.4 cm为穿刺点，钻孔穿颅。进针深度3.0 mm至双侧海马，一次性注射 Aβ25~351 μL（10 μg），5 min内缓慢注入，并留针5 min。伤口撒少许青霉素钠粉末后进行缝合，碘酒常规消毒，术后连续3 d腹腔注射青霉素钠预防感染［6］。空白组不做处理。

1.2.3 取材 治疗结束后，各组取10只大鼠，经腹腔注射10%水合氯醛380 mg/kg麻醉后，快速在生理盐水冰面上取脑，分离海马组织，称取组织重量加9倍生理盐水，冰浴中3000 r/min离心10 min，匀浆10次，制备成10%脑匀浆。-80℃冰箱中保存，待测CaM含量。每组取10只经心脏行灌注固定：经腹腔注射10%水合氯醛380 mg/kg麻醉后，剪开胸廓找到心脏，于心尖处插入灌注针头，快速滴入冷生理盐水200 mL，接着注入350 mL 4%多聚甲醛，取出脑组织后置于4%多聚甲醛中放入4℃冰箱固定。待观察大鼠海马组织形态结构变化及CREB、p-CREB表达。

1.2.4 检测指标 造模后15 d对各组大鼠进行Morris水迷宫训练观察GS对AD大鼠学习记忆的影响。训练1次/d，共6 d。训练时选择1个入水点，将大鼠面向池壁放入水中，观察并记录大鼠寻找并爬上平台所需时间（逃避潜伏期）。如果大鼠在120 s内未找到平台，需将其引至平台，这时潜伏期为120 s。训练期间水温保持在（26±1）℃，迷宫外参照物保持不变。将各组第6天的成绩进行比较，数据采集和处理由Morris水迷宫图像自动监视处理系统完成。

将固定的大鼠脑组织进行常规病理切片和HE染色后，观察海马组织形态并进行图像采集。采用ELISA法按试剂盒说明检测AD大鼠CaM含量。采用免疫组化SP法检测海马组织CREB、p-CREB。严格按照试剂盒操作方法，DAB显色，苏木精复染，最后脱片、透明及封片。

在显微镜下观察每张切片海马 CA1、CA2、CA3、CA4区域并随机各取1个视野拍照。神经元胞核内染棕黄色为CREB或p-CREB阳性表达，采用JEDA 801D形态学图像分析系统拍照并统计阳性表达的平均光密度（mean optical density，MOD）。

1.3 统计学方法

用SPSS13.0软件进行统计学处理。所有试验数据采用均数±标准差（±s）表示。组间用单因素方差分析，多组之间两两比较采用LSD法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 对AD大鼠Morris水迷宫成绩的影响

Morris 水迷宫实验显示，Blank、OVX、GS-H、GS-M、GS-L、EV组大鼠逃避潜伏期分别为（15.79±6.42）s，（24.55±7.10）s，（13.58±7.30）s，（16.39±5.07）s，（17.67±6.87）s，（17.51±7.83）s。与空白组对比，模型组逃避潜伏期明显延长（P＜0.01）；与模型组比较，染料木素高、中、低剂量组和戊酸雌二醇组逃避潜伏期明显缩短（P＜0.01）；与戊酸雌二醇组相比，染料木素高剂量组逃避潜伏期显著缩短（P<0.05），染料木素中、低剂量组逃避潜伏期差异无统计学意义。

2.2 对AD大鼠海马组织形态学变化的影响

在光镜下观察，Blank组大鼠的海马细胞染色均匀，胞核完整、形态完好呈锥形、排列规则。GS-H组神经细胞排列紧密，染色均匀。模型组海马神经细胞排列紊乱，数量减少且层数也减少，锥体细胞颗粒空泡变性，并出现许多有空晕的固缩细胞。GS-M组脑组织神经细胞少数出现上述变化。GS-L组胞核固缩的神经细胞多见，EV组神经细胞破裂者较多。结果见图1。

图1 各组大鼠海马组织CA3区形态结构变化（HE×400）

2.3 对AD大鼠海马CaM含量、CREB及p-CREB表达的影响

由表1可见，与Blank组比较，OVX组海马组织CaM含量、CREB及p-CREB的MOD显著升高（P<0.01）；与OVX组比较，染色木素各剂量组、EV组海马组织CaM含量及CREB及p-CREB的MOD均显著降低（P<0.05，P<0.01）；与 EV 组比较，GS-L组p-CREB的MOD显著升高（P<0.05）。Blank组大鼠海马组织 CREB、p-CREB呈轻度表达；OVX组CREB、p-CREB呈强阳性表达；GS-H组、GS-M组和 EV组 CREB、p-CREB呈中度表达；GS-L组CREB、p-CREB呈高度表达。结果见表1、图2、图3。

表1 染料木素对AD大鼠海马CaM含量、CREB及p-CREB表达的影响 （±s）

表1 染料木素对AD大鼠海马CaM含量、CREB及p-CREB表达的影响 （±s）

注：与 Blank 组比较，1）P<0.01；与 OVX 组比较，2）P<0.05，3）P<0.01；与 EV 组比较，4）P<0.05

组别n剂量（mg/kg）CaM/（ng/L）CREB（MOD）p-CREB（MOD）Blank 组 10 - 80.51±9.980.252±0.0120.219±0.021 OVX 组 10 - 93.75±9.851） 0.350±0.0211） 0.325±0.0181）GS-H 组 109073.79±6.153） 0.272±0.0192） 0.267±0.0162）GS-M 组 103078.96±12.973） 0.284±0.0142） 0.281±0.0202）GS-L 组 101082.50±7.282） 0.291±0.0202） 0.289±0.0172）4）EV 组 100.474.78±9.243） 0.282±0.0162） 0.269±0.0112）

图2 各组大鼠海马组织CA3区CREB的表达（SP×400）

3 讨 论

图3 各组大鼠海马组织CA3区p-CREB的表达（SP×400）

海马是学习记忆的重要部位，而AD病的最显著特征之一就是学习记忆能力障碍。AD的主要病理变化为脑内神经细胞颗粒空泡样变性以及神经原纤维缠结（Neurofibrillary tangles，NFT）［7］。实验证明，雌激素水平增高时，可以对受损的神经元发挥保护效应，抑制凋亡，减少AD的发生［8］。而GS具有类雌激素样的作用，是防治AD的理想药物。脑内注射Aβ25-35可以出现类似AD的病理变化，因此本实验采用了Aβ25-35造模。海马组织病理切片观察显示，Blank组海马组织神经细胞排列整齐。OVX组海马CA1区神经元排列紊乱，层数减少，神经元数目较假手术组明显减少。锥体细胞颗粒空泡样变性，部分细胞凋亡，出现体积缩小，细胞核破裂至细胞呈红色。GS-H组海马CA1区的锥体细胞颗粒空泡样变性减少，神经细胞丢失明显减少。低、中剂量组也有类似变化。

AD的发病与神经元钙稳态失调有关，这种失调发生于神经元、星型胶质、少突胶质和小胶质细胞中，直接导致神经元结构和功能的失常及细胞的坏死［9］。CaM是细胞中一种重要的多功能蛋白，它可以激活40多种酶或者通道，参与许多生物功能。CaM不仅参与了神经元和星形胶质细胞的信号级联放大系统，参与突触可塑性、细胞分化和增生，还在长时程增强效应和学习记忆中起重要作用［10-11］。AD发病时神经元内Ca2+超载，Ca2+激活钙调蛋白（CaM），成为有活性的钙-钙调蛋白复合物（Ca2+/CaM）。Ca2+/CaM激活钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（calmodulindependent protein kinase Ⅱ，CaMKII），CaMKII可使CREB磷酸化，磷酸化CREB激活下游调控基因的表达，最终导致神经元损伤/抗损伤平衡的失调而引起细胞死亡，引起记忆功能障碍，最终形成AD。本实验结果表明：在Aβ海马注射造AD大鼠模型后，大鼠海马CaM、CREB和p-CREB蛋白表达增加，染料木素可明显改善AD大鼠学习记忆能力；染料木素可明显减少AD大鼠海马组织神经元的丢失，具有神经保护作用；染料木素可显著性降低AD大鼠海马组织CaM的含量，降低海马组织CREB和p-CREB的表达。

本实验结果表明，染料木素可能通过减少Aβ在大鼠海马的沉积，减少神经元钙超载以稳定神经元钙稳态平衡，从而减少CaM、CREB和磷酸化CREB的含量，减少海马神经元丢失，改善学习记忆的能力，起到预防AD的作用。

［1］Song W O，Chun O K，Hwang I，et al.Soy isoflavones as safe functional ingredients［J］.J Med Food，2007，10（4）：571-580.

［2］Wang L，Andersson L，Warnet M，et al.Morphological abnormalities in the brain of estrogen receptor β knockout mice［J］.PNAS，2001，98：2792-2796.

［3］Reiter E，Beck V，Medjakovic S，et al.Isoflavones are safe compounds for therapeutical applications-Evaluation of in vitro data［J］.Gynecol Endocrinol，2009，7（7）：1-27.

［4］Linford N J，Dorsa D M.17 beta-Estradiol and the phytoestrogen genistein attenuate neuronal apoptosis induced by the endoplasmic reticalum calcium-ATPase inhibitor thapsigargin［J］.Steroids，2002，67（13/14）：1029-1040.

［5］Bang O Y，Hong H S，Kim D H，et al.Neuroprotective effect of genistein against beta amyloid-induced neurotoxicity［J］.Neurobiol Dis，2004，16（1）：21-28.

［6］李仪奎.中药药理实验方法学［M］.2版.上海：上海科技出版社，2006：293-294.

［7］王维治.神经病学［M］.北京：人民卫生出版社，2008：1397-1400.

［8］王超，肖茜，王剑波，等.染料木素对海马齿状回神经再生的研究与展望［J］.亚太传统医药，2008，7（4）：25-28.

［9］Mattson M P，Chan S L.Neuronal and glial calcium signaling in Alzheimer′s disease［J］.Cell Calcium，2003，34（4/5）：385-397.

［10］Zhao L，Zhao Q，Lu R，et al.Effects of tyroserleutide on gene expression of calmodulin and PI3K in hepatocellular carcinoma［J］.Cell Biochem，2008，103（2）：471.

［11］Zhao L X，Roberta D B.Vasopressin-induced cytoplasmic and nuclear calcium signaling in embryonic cortical astrocytes：dynamics of calcium and Calcium-dependent kinase translocation［J］.Neuroscience，2003，23（10）：4228.