补血养肝法对血虚证小鼠肝细胞凋亡的影响

王正引 ，张小如 ，郭明章 ，全世建

（1.福建中医药大学药学院，福建福州350122； 2.广州中医药大学中药学院，广东广州510006；

3.福建中医药大学中医学院，福建福州350122）

近年来已有研究报道，补益类方药如枸杞［1］、右归饮［2］对细胞凋亡有一定抑制作用，表明补益类方药的作用机理可能与其干预细胞凋亡有关。中医藏象理论认为肝藏血，《素问·五脏生成》曰“故人卧血归于肝，肝受血而能视。”肝可贮藏血液，调节血量，以濡养脏腑，维持机体功能的正常发挥。肝藏血不足是造成血虚证的主要原因之一。本研究基于肝藏血的理论，通过观察补血养肝法对血虚证小鼠肝细胞凋亡的影响，希冀进一步探讨补血养肝法作用机理。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 C57BL/6J小鼠，清洁级，30只，雌雄各半，体重（20±2）g，上海斯莱克实验动物有限公司提供［动物许可证号：SCK（沪）2012-0002］。

1.1.2 药物及制备 补血养肝法的代表方选用四物汤，按《方剂学》［3］规定的剂量称取，熟地 15 g，当归9 g，白芍9 g，川芎6 g，按传统方法水煎，煎煮2次，取2次水煎液合并后浓缩成含生药量约l g/mL，置4℃保存备用。实验时稀释成25%。

1.1.3 试剂与仪器 注射用环磷酰胺（通化茂祥制药有限公司，批号120801），TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒（瑞士Roche公司），全自动血液分析仪（日本Sysmex公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 分组 30只C57BL/6J小鼠随机分为空白组、模型组、实验组3组，每组10只。

1.2.2 造模 小鼠常规饲养数天适应环境后，参照化学损伤法［4］造模，模型组、实验组于实验第1天按小鼠体重0.1 g/kg腹腔注射环磷酰胺1次，空白组予等体积生理盐水腹腔注射。

1.2.3 给药实验组予四物汤5 g/（kg·d）灌胃，1次/d，连续灌胃7 d。空白组和模型组则给予等体积生理盐水。

1.2.4 外周血象检测 在实验第7天，给药1 h后，每只小鼠眼眶后静脉丛取血，检测外周血红细胞数、白细胞数、血小板数及血红蛋白含量。

1.2.5 标本采集及指标检测 在实验第8天，颈椎脱臼处死，剖腹取肝脏，4℃生理盐水冲洗，滤纸吸干，肝右前叶切取1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm组织块，以10%甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，以备用于原位末端标记（TUNEL）法检测细胞凋亡。按TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒说明书操作，用蛋白酶K室温孵育30 min。磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗2次，滴加50 μL的TUNEL反应混合溶液，在湿盒中37℃孵育60 min。PBS冲洗3次，加入50 μL转化剂辣根过氧化物酶（POD），在湿盒中37℃孵育30 min。PBS冲洗3次，加入100 μL二氨基联苯胺（DAB）底物溶液，室温孵育10 min，PBS冲洗3次。苏木素复染，封片。每张TUNEL切片选取5个阳性细胞数最多的高倍镜视野（×400），每个视野计算100个肝细胞，选取其中的阳性细胞，计算阳性细胞数与总细胞数的百分比，即凋亡百分率。在光镜下分析结果。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 各组小鼠外周血象比较

结果见表1。

表1 各组小鼠外周血象比较 （±s）

表1 各组小鼠外周血象比较 （±s）

注：与模型组比较，1）P＜0.05

组别 n 红细胞（1012/L）白细胞（109/L）血小板（109/L）血红蛋白（g/L）空白组 109.84±0.691） 6.44±1.591） 1039.30±229.93149.90±10.401）模型组 107.51±0.734.67±1.251127.40±218.62120.30±10.06实验组 108.71±0.681） 6.28±1.991） 1238.80±298.23134.20±7.361）

由表1可见，与模型组相比，实验组外周血红细胞计数、白细胞计数以及血红蛋白含量均升高（P＜0.05），血小板计数各组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 肝细胞凋亡

经TUNEL试剂盒染色，细胞核呈现出棕黄色或棕褐色染色的细胞为阳性细胞，细胞核蓝染的细胞是苏木素复染的阴性细胞。

空白组肝细胞凋亡百分率为（17.60±7.15）%，模型组为（30.10±6.74）%，实验组为（17.80±5.61）%，模型组较空白组明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，实验组肝细胞凋亡百分率明显降低（P＜0.05）。结果见图1。

空白组

模型组

图1 肝细胞凋亡图

3 讨论

对于补血方药的补血作用机理的研究，近年来多数集中从免疫功能、骨髓造血功能等方面来探讨。谭允育等［5］研究表明，四物汤可明显改善60Co照射的血虚证模型小鼠的免疫功能，其中有显著差异的包含了红细胞抗体、溶血素、外周血B细胞、迟发型超敏反应、T细胞数。薄华本等［6］研究发现，当归补血汤可能通过改善基质细胞的状态、增强骨髓细胞之间的黏附来改善骨髓造血微环境。吴宏忠等［7］研究表明，阿胶有效补血活性成分可升高红、白细胞，其作用机制可能与保护贫血小鼠造血微环境和造血干、祖细胞，刺激髓外造血器官相关造血细胞因子表达有关。如前所述，补血方药的作用机制之一，可能是通过增强细胞免疫功能，促进骨髓造血，从而达到补血目的。

细胞凋亡是属于受基因调控的程序性细胞死亡过程，对于机体器官功能正常发挥，保持自身稳定发挥重要作用。因此对细胞凋亡干预机制的研究，已成为目前药物研发的热点。国内已有学者从抑制细胞凋亡角度，探讨补益类方药的作用机理。杜江等［8］研究表明，龟鹿二仙胶可抑制模型大鼠软骨细胞Bax的表达和促进Bcl-2的表达，抑制去势骨关节炎大鼠关节软骨细胞凋亡。赵志明等［9］研究发现，何首乌饮可增加大鼠卵巢颗粒细胞内凋亡抑制蛋白Bcl-2表达，减少凋亡促进蛋白Bax表达，而发挥凋亡抑制作用。郑鸿燕等［10］研究表明，当归补血汤对感音神经性聋大鼠耳蜗干细胞移植后细胞凋亡有抑制作用。

四物汤是由《金匮要略》胶艾汤化裁而来。方中君药熟地甘温味厚，入肝、肾经，长于补血滋阴，填精益髓；臣药当归甘辛温，归肝、心、脾经，补血活血；佐以白芍酸甘微寒，入肝、脾经，养血柔肝；川芎辛温入肝、胆、心包经，活血行气。全方四味药均入肝经，可补血养肝，用于治疗血虚证。因此本研究选用四物汤作为补血养肝法的代表方，从细胞凋亡的角度，探讨该法补血作用机理。

本研究结果表明，补血养肝法可改善血虚证小鼠的外周血象，降低肝细胞凋亡百分率，提示补血养肝法作用机理可能与其减少肝细胞凋亡有关，但对于肝细胞凋亡的干预机制还有待进一步研究。

［1］汪君民.枸杞对运动大鼠肾脏 Bcl-2、Bax表达和运动性蛋白尿的影响［J］.西安体育学院学报，2009，26（6）：719-724，730.

［2］陈瑜，沈自尹，陈伟华.补肾及健脾复方对皮质酮大鼠T细胞凋亡信号相关基因群调控模式的对比研究［J］.中西医结合学报，2004，2（5）：346-349.

［3］李冀.方剂学［M］.3版.北京：中国中医药出版社，2012：129.

［4］陈奇.中药药理研究方法学［M］.2版.北京：人民卫生出版社，2006：1169.

［5］谭允育，黄守雄，栾永红，等.四物汤对60Co照射小鼠免疫功能影响的实验研究［J］.中国实验临床免疫学杂志，1994，6（2）：40-43.

［6］薄华本，陈启助，沈晗，等.当归补血汤调控骨髓造血机理及对造血微环境的影响［J］.中国新药与临床杂志，2013，32（10）：824-828.

［7］吴宏忠，杨帆，崔书亚，等.阿胶酶解成分对贫血小鼠造血系统的保护机制［J］.华东理工大学学报：自然科学版，2008，34（1）：47-52.

［8］杜江，黄远鹏，李奕修，等.龟鹿二仙胶及其拆方对去势骨关节炎大鼠关节软骨中Bax和Bcl-2的影响［J］.中国中医骨伤科杂志，2013，21（3）：4-7.

［9］赵志明，杜元杰，左一鹏，等.中药何首乌饮对大鼠卵巢颗粒细胞凋亡相关蛋白bcl-2，bax表达的影响［J］.现代中西医结合杂志，2012，21（23）：2530-2532，2564.

［10］郑鸿燕，邰浩清，曾水林.当归补血汤对感音神经性聋大鼠耳蜗干细胞移植后细胞凋亡的影响［J］.听力学及言语疾病杂志，2010，18（3）：271-274.