益气除痰方下调vimentin表达与逆转 EMT相关性研究※

● 周京旭 林丽珠▲ 王淑美



益气除痰方下调vimentin表达与逆转EMT相关性研究※

● 周京旭1林丽珠1▲王淑美2

目的：观察益气除痰方肺癌肿瘤生长、肺转移的影响，并通过差异蛋白组学技术筛选出差异表达蛋白vimentin，并结合相关技术分析其可能的意义。方法：C57BL小鼠40只，接种Lewis肺癌细胞，造模第2天，随机分为对照组(生理盐水)和低、中、高剂量观察组予益气除痰方1.0g·kg-1·d-1，3.0g·kg-1·d-1，9.0g·kg-1·d-1，每组10只，灌胃21d后，检测肿瘤体积、重量、肺转移灶，分别提取最佳剂量治疗组和模型组肿瘤组织的总蛋白，应用双向荧光差异凝胶电泳(2D-DIGE)系统获得蛋白点表达差异信息，运用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-TOF)鉴定出差异蛋白质。并以荧光定量PCR和Western blot法对差异蛋白进行表达差异鉴定。培养A549细胞，20%益气除痰方含药血清干预，划痕实验分析细胞侵袭、转移能力的改变，RT-PCR检测其对A549肺癌细胞MMP-1、MMP2、MMP9、MMP14mRNA基因表达的影响。结果：益气除痰方3.0g·kg-1·d-1治疗组肿瘤体积、瘤重、肺转移灶数均明显小于LEWIS模型组(P<0.01)，肿瘤抑制率为57.21%。蛋白质组学研究鉴定受益气除痰方调控影响的蛋白37个，其中vimentin下调尤其明显。20%益气除痰方含药血清可抑制A549细胞的侵袭和转移能力，并能降低MMP2、MMP14mRNA基因的表达，与空白组比较差异有显著性(P<0.01)。结论：益气除痰方明显下调vimentin表达，抑制A549细胞的运动能力，减少基质金属蛋白酶MMP2、MMP14的分泌，这可能与益气除痰方逆转肺癌细胞上皮-间质转化有关，值得进一步研究。

益气除痰方 LEWIS肺癌 上皮-间质转化

上皮间质细胞转化是具有极性的上皮细胞转换成为具有移行能力的间质细胞并获得侵袭和迁移能力的过程，上皮细胞标志——E-钙黏素和细胞角蛋白的表达受到抑制，而诱导表达一种间叶细胞骨架中间纤维组成成分波形蛋白(vimentin)，同时获得分泌基质金属蛋白酶的能力[1,2]。益气除痰方由党参、生法夏、守宫、露蜂房等组成，通过健脾益气、化痰散结达到固本抑瘤、兼治标本的功效。临床研究证明，益气除痰方能够明显延长非小细胞肺癌肺癌患者的生存期，提高生存质量。其疗效既和抑制肺癌的生长有关，也和降低肺癌的转移有关，使患者能较长期的“带瘤生存”，达到治疗目的[3,4]。

本实验采用比较蛋白质组学的方法，鉴定分析发现益气除痰方明显降低LEWIS肺癌细胞vimentin的表达，并进一步分析了调节vimentin表达的意义。

1 材料与方法

1.1材料益气除痰方(Yiqi Chutan Tang，YQCT)按组成严格称取鉴定。经煮液，过滤，浓缩至含生药量2g/ml，密闭4℃保存备用。Cy Dye荧光染料(Cy 2，Cy 3，Cy 5)、CHAPS、两性电解质(pH 3～10 NL)、DTT、24cm IPG 胶条(pH 3～10 NL)、碘乙酰胺(IAA)、Clean-up试剂盒、2D Quant试剂盒等均购自AmershamBioscience公司。IPG-phorⅡ等电聚焦仪、DALT Six电泳系统、Typhoon9400系列多功能激光扫描成像系统、DeCyder差异分析软件和MALDI-TOF-TOF质谱均为Amersham Bio science公司产品。

1.2方法

1.2.1 造模与给药 SPF级C57BL小鼠40只，18～20g，雌雄各半。C57BL小鼠d1右腋皮下接种1×107个Lewis肺癌细胞。接种d2开始用药，治疗组予益气除痰方1.0g·kg-1·d-1，3.0g·kg-1·d-1，9.0g·kg-1·d-1，灌胃，给药量为0.5mL/只，每天1次，连续灌胃21d；对照组予生理盐水。接种后每3d称量一次体重，d 22处死小鼠，检测各组肿瘤体积、重量、肺转移灶，取肿瘤组织-80℃保存备用。

1.2.2 双向电泳[5]用蛋白裂解液提取中剂量实验组和对照组蛋白，用改良的Bradford法测定提取蛋白样品的蛋白浓度。荧光标记G1对照组(CY3)，治疗组(CY5)，CY2标记内标；G2胶反标记对照组(CY5)，治疗组(CY3)，CY2标记内标。将上述三个标记好的样品混合，进行等点聚焦、SDS-PAGE电泳。凝胶图像分析，筛选出在两组中差异表达的蛋白质。

1.2.3 制备质谱样品及质谱分析 将G1、G2胶进行质谱分析，蛋白质原位酶解，MALDI-TOF-TOF肽质量指纹图测定，蛋白质鉴定数据库查询通过Internet在ExPASY的Peptdent软件进行搜寻。选择合适参数，进行匹配。Western blot验证差异蛋白的表达情况。

1.2.4 划痕细胞迁移试验[6]6孔板长满细胞单

层后，用灭菌10uL枪头沿细胞中部划一条直线，洗去细胞碎片，每组设3个复孔，治疗组予20%含药血清，对照组予20%无药血清，相差显微镜观察划痕愈合程度，计算迁移率=1-实验组/对照组×100%。

1.2.5 RT-PCR检测MMP-1、MMP2、MMP9、MMP14mRNA的表达[6]A549细胞经20%含药血清处理24h，Trizol法总RNA，逆转录成cDNA，进行PCR扩增。设置PCR扩增条件为：94℃2分钟；94℃25秒；55℃30秒；72℃30秒；72℃5秒，循环25次。扩增产物1.5%的琼脂糖电泳后，紫外灯观察拍照。Quantity one软件分析定量。见表1。

表1 引物序列

2 结果

2.1益气除痰方对肿瘤生长的影响无论肿瘤体积、瘤重、肺转移灶数益气除痰方治疗组均明显小于对照组组(P<0.01)，其中，中剂量组3.0g·kg-1·d-1肿瘤抑瘤效果最好，最大抑瘤率57.21%。见表2。

表2 益气除痰方治疗21天对小鼠Lewis肺癌实体瘤生长的影响

注：与LEWIS肺癌模型组比较*P<0.05，**P<0.01。

2.2 2D-DIGE胶图分析结果分析以统计学参数：差异参数T-TEST<0.05，差异倍数参数：RITIO<-1.5or>1.5为标准，筛选出治疗组与对照差异蛋白点44个，其中治疗后上调表达蛋白6个，下调表达蛋白38个。

2.3质谱鉴定结果治疗组与对照组44个差异表达蛋白经质谱成功鉴定出37个蛋白，其中波纹蛋白vimentin下调表达最显著。见表3。

表3 治疗组vimentin的差异表达

2.4 Western blot法对部分差异蛋白鉴定结果显示益气除痰治疗组，vimentin，prolyl 4-hydroxylase，protein disulfide-isomerase A3 precursor，EG433182 protein表达水平较模型组下降，与蛋白质组学实验结论一致。见图1。

图1益气除痰方对小鼠Lewis肺癌组织表达Vimentin的影响(内参为β-Actin)(Western blot，n=10)

2.5益气除痰方含药血清对A549细胞迁移的影响12h后，20%含药血清组A549细胞迁移率分别为(18.6±2.8)%，对照组为(43.3±2.9)%；24h后，20%含药血清组细胞的迁移率分别为(43.1±3.3%)，对照组已经长满。两组比较差异有统计学意义(P<0.01)。

2.6益气除痰方含药血清对A549细胞MMP1、MMP2、MMP9、MMP14mRNA表达的影响与对照组比较，治疗组可明显降低MMP2、MMP14 mRNA的表达，有显著性差异(P<0.01)，而MMP1、MMP9mRNA的表达改变不明显，无显著性差异(P<0.01)。见图2。

图2 益气除痰方含药血清对A549细胞MMP1、MMP2、MMP9、MMP14mRNA的影响

3 讨论

肺癌的浸润转移，是其治疗失败的主要原因之一。而肿瘤细胞必须获得侵袭转移的能力，突破基底膜，必须由上皮形态转化为间质形态，因而上皮间质细胞转化是肿瘤发生转移的关键步骤。癌细胞发生上皮间叶细胞转移时，丧失了上皮细胞极性，E-钙黏素和细胞角蛋白的表达受到抑制；获得了成纤维细胞形态，运动侵袭能力、N-钙黏素和波形蛋白表达，基质金属蛋白酶和纤连蛋白分泌。EMT通常由肿瘤所处的环境信号激发。也就是说，处于原发灶侵袭性前缘的肿瘤细胞可以从邻近的反应性基质中获得特异性信号，从而获得向间质细胞转化的能力[1,2]。事实上，多种恶性肿瘤如乳腺癌、肝癌、前列腺癌、肺癌、肠癌等的侵袭转移过程均观察到EMT现象，而且肿瘤组织中的发生EMT的肿瘤细胞数目直接与病变组织的侵袭转移程度相关。肿瘤细胞发生EMT后，侵袭转移能力明显增强。用EMT调节因子Twist处理后乳腺癌细胞，Ax1表达上调，侵袭转移能力明显增强[7]；过表达EMT相关的转录因子Snail/Twist可促进肝癌细胞EMT的发生，肝癌细胞转移能力增加，而沉默Snail/Twist，使肝癌细胞转移能力明显受到抑制[8]。而肺癌发生EMT促进肿瘤的进展、转移、耐药，不仅是化疗药物，也包括对分子靶向药物EGFR TkI的耐药。肺腺癌细胞株A549经TGF-β1孵育21天以后，转变为EMT表型的A549-M，其迁徙、转移能力明显增强[9]。而用RNAi抑制Snail后，则明显降低其体外侵袭转移能力[10]。

益气除痰方可以明显抑制肿瘤的生长，减少肺转移的发生。而上皮间质转化是肿瘤转移的首要条件。因而理论上推测益气除痰方是也抑制A549细胞EMT的发生。可以从以下几个方面进行探讨：(1)肿瘤细胞是否发生了形态学的变化，如从梭形细胞变成圆形细胞；(2)细胞运动迁移能力是否发生改变；(3)一些上皮和间叶组织的细胞标志物是否发生改变。

研究表明，肿瘤侵袭前缘的癌细胞选择性表达Vimentin，细胞也变成一种拉伸的纤维母细胞形态，而内部的癌细胞不表达Vimentin，细胞也维持上皮样形态[1]。本研究发现益气除痰方可明显抑制Vimentin表达，可能使细胞保持上皮样形态，也可能与抑制肿瘤上皮向间叶细胞转化有关。

其次，细胞迁移运动能力的下降，基质金属蛋白酶的分泌减少也是抑制EMT的表现之一。用益气除痰方含药血清处理人肺癌A549细胞株，划痕实验发现能明显抑制细胞的迁移；同时RT-PCR也发现益气除痰方含药血清降低MMP-2、MMP-14mRNA基因的表达。而基质金属蛋白酶是细胞突破基底膜，在细胞外基质中运动最重要的效应分子[11]。

一些上皮和间叶组织的细胞标志物比如E-cad和N-cad是否发生改变尚待检测，但益气除痰方逆转EMT抑制肺癌转移、耐药现象，将成为今后工作新的重点领域。

[1]Micalizzi DS，Farabaugh SM，Ford HL.Epithelial-mesenchymal transition in cancer：parallels between normal development and tumor progression.J Mammary Gland BIol Neoplasia，2010，15：117-134.

[2]Zeisberg M，Neilson EG.Biomarkers for epithelial-mesenchymal transitions.J Clin Invest 2009，119：1429-1437.

[3]周岱翰，林丽珠，周宜强，等.益气除痰法延长非小细胞肺癌中位生存期的作用.中医杂志，2005，46(8)：600-602.

[4]周岱翰，林丽珠，周宜强，等.中医药治疗III-VI期非小细胞肺癌的预后因素分析.癌症，2005，24(10)：1252-1256.

[5]Shumei-Wang，Lizhu-Lin，Jingxu-Zhou，Shaoquan-Xiong. The effect of Yiqi Chutan Tang on proteome in LEWIS lung cancer in mice ASIAN PACIFIC JOURNAL OF CANCER PREVENTION.2011，12(7)：1665-1669.

[6]史海岭，刘 芬，郭晓军，等.黄连素对肺腺癌A549细胞增殖、迁移与黏附的影响.中国癌症杂志，2009，19(12)：910-914

[7]Gjerdrum C，Tiron C，Hoiby T，et al.Ax1 is an essential epithelial-to-mesenchymal transition-induced regulator of breast cancer metastasis and patient survival.Proc Natl ACad Sci USA，2010，107(3)：1124-1129.

[8]Yang MH，Chen CH，Chau GY，et al.Comprehensive analysis of the indepent effect of twist and snail in promoting metastasis of hepatocellular carcinoma.Hepatology，2009;50(5)：1464-1474.

[9]Maitah M Y，Ali S，Ahmad A.Up-Regulation of Sonic Hedgehog Contributes to TGF-b1-Induced Epithelial to Mesenchymal Transitionin NSCLC Cells.PLoS One，2011，6(1)：e16068.

[10]卓文磊，张云嵩，王 彦，等.RNA干扰抑制Snail表达对A549细胞上皮-间充质转分化及体外侵袭的影响.现代肿瘤医学，2008，16(6)：889-893.

[11]Delassus GS，Cho H，Hoang S，et al。Many new down- and up-regulatory sign aling pathways，from known cancer progression suppressors to matrix metalloproteinases，differ widely in cells of various cancers.J Cell Physiol，2010，224(2)：549-58.

国家自然科学基金资助项目(No.30772862 )

林丽珠，女，主任医师，教授，博士研究生导师。E-mail：lizhulin903@21cn.com。

1.广州中医药大学第一临床学院肿瘤科(510405)；2.重庆医科大学中医药学院(401331)

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