高氧对新生小鼠视网膜谷氨酸释放的影响*

彭振宇，高 玲，彭湘萍

(1.中南大学湘雅二医院眼科，湖南 长沙 410011；2.湘西自治州人民医院，吉首大学附属第一医院眼科，湖南 吉首 416000；3.吉首大学医学院，湖南 吉首 416000)

高氧对新生小鼠视网膜谷氨酸释放的影响*

彭振宇1,2，高 玲1，彭湘萍3

(1.中南大学湘雅二医院眼科，湖南 长沙 410011；2.湘西自治州人民医院，吉首大学附属第一医院眼科，湖南 吉首 416000；3.吉首大学医学院，湖南 吉首 416000)

为研究新生小鼠高氧状态下视网膜谷氨酸摩尔质量浓度的变化及其机制，探讨谷氨酸在高氧视网膜损伤中的作用，实验组将新生小鼠置于体积分数为95%的高氧环境中造成视网膜损伤，对照组将新生小鼠置于正常空气中，HE染色观察视网膜损伤情况，多功能酶标仪检测视网膜谷氨酸(Glu)摩尔质量浓度变化，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测视网膜谷氨酸转运体(GLAST)与谷氨酰胺合成酶(GS)mRNA表达情况.结果发现，与空气对照组比较，高氧处理组视网膜受损，视网膜Glu摩尔质量浓度增加，GLAST和GS mRNA表达下降(P<0.05).高氧可导致新生小鼠视网膜的谷氨酸增高，其机制与GLAST和GS mRNA表达下降有关.谷氨酸增加可能是高氧导致视网膜损伤的原因之一.

高氧；谷氨酸；视网膜；新生；小鼠

早产儿视网膜病(Retinopathyofprematurity，ROP)是一种形成机制未明的视网膜增值性病变，致盲率高.其发生与早产儿吸高浓度氧气有密切关系[1].谷氨酸(glutamate，Glu)是视网膜主要的兴奋性神经递质,过多的谷氨酸通过激活谷氨酸受体可引发兴奋性毒性作用，导致视网膜神经细胞损伤.神经胶质细胞通过L-谷氨酸/L-天门冬氨酸转运体(L-glutamate/L-aspartate transporter，GLAST)摄取谷氨酸，在细胞内谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)作用下将谷氨酸转变为谷氨酰胺，对维持细胞外谷氨酸的正常水平发挥重要作用.目前，高氧是否影响新生小鼠视网膜谷氨酸变化未见报道.笔者分析了在高氧状态下视网膜谷氨酸摩尔质量浓度(单位质量所含谷氨酸物质的量，单位：mol/g)变化及其相关机制.

1 材料与方法

1.1模型制备及分组

健康的成年昆明小鼠，由湖南省斯莱克景达实验动物有限公司提供.雌雄合笼制备孕鼠，孕鼠顺产新生小鼠，出生后随机分为空气对照组和高氧处理组，每组25只.空气对照组置于正常空气中，高氧组小鼠置于氧体积分数大于等于95%的有机玻璃箱内，每天监测氧浓度3次，钠石灰吸收CO2.每天开箱1次，检查情况，更换垫料.高氧处理5 d后置于正常空气中5 d.

1.2HE染色观察视网膜改变

每组4只小鼠，断头处死，取双眼眼球置于质量浓度为0.04 g/mL多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，常规HE染色，观察视网膜病变.

1.3谷氨酸摩尔质量浓度测定

每组15只小鼠，每3只小鼠6个眼球为1个样本.取眼球后置于冰上，剪除角膜和玻璃体，研磨，制备质量浓度为0.1 g/mL组织匀浆，按照试剂盒说明书操作,用多功能酶标仪测定340 nm吸光度值,计算Glu摩尔质量浓度.

1.4逆转录聚合酶链反应

每组6只小鼠,每2只小鼠4个眼球的视网膜为一个检测样本.取眼球后，立即置于液氮并研磨，Trizol法提取总RNA，各标本取0.5g总RNA按cDNA第一链合成试剂盒说明书进行逆转录.GLAST引物序列上游5-CTCTCCTCTACTTCCTGGTA-3，下游5-GTGGCTGTGATGCTTATTG-3；GS引物序列上游5-GGGGTGATAGCAACCTTTGA-3，下游5-ACTGGTGCCTCTTGCTCAGT-3；内参GAPGH，引物序列上游 5-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3，下游5-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG-3；PCR扩增长度分别为301,151,233 bp.PCR反应条件：94 ℃下预变性4 min，94 ℃下变性30 s，60 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸45 s，30个循环，72 ℃ 10 min继续延伸.反应结束后，取RT-PCR产物行质量浓度0.02 g/mL琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像分析系统对电泳条带拍照并加以分析，以各组目的基因与内参基因的吸光度值的比值比较目的基因mRNA表达差异,每组实验重复3次.

1.5统计学方法

2 结果与讨论

2.1视网膜改变

视网膜改变如图1所示.HE染色显示：空气对照组视网膜各层结构完整，形态规整，内外核层细胞核染色均匀，边界清晰，未见突破视网膜内界膜的血管内皮细胞.高氧处理组显示：神经细胞肿胀变圆，结构欠清，可见大量突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核.

图1 视网膜改变(HE染色 ×200)

2.2谷氨酸摩尔质量浓度变化

图2 新生小鼠视网膜谷氨酸摩尔质量浓度比较

空气对照组视网膜谷氨酸摩尔质量浓度为(6.45±1.26)μmol/g，高氧处理组视网膜谷氨酸增高为(14.75±1.64) μmol/g，较空气对照组增加，具有统计学意义(P<0.05，n=5)，如图2所示.

2.3GLAST和GSmRNA表达变化

凝胶电泳结果显示，如图3a)，233 bp为内参GAPDH条带，301 bp为GLAST条带，高氧处理组GLAST表达条带减弱.经统计学分析，高氧组GLAST mRNA表达的相对灰度值与空气对照组相比有统计学意义(P<0.05).如图3b)，233 bp为内参GAPDH条带，151 bp为GS条带，高氧处理组GS表达条带减弱.经统计学分析，高氧组GS mRNA表达的相对灰度值与空气对照组相比有统计学意义(P<0.05).

a GLAST mRNA7

b GS mRNA7

3 结论与分析

(1) 谷氨酸是存在于中枢神经系统包括视网膜在内的重要神经递质，参与机体正常状态下的一系列重要生理活动.谷氨酸在神经元细胞外的低浓度维持主要依赖于谷氨酸转运体作用，谷氨酸进入神经胶质细胞内转换为谷氨酰胺对抗兴奋毒性而发挥保护神经元的作用.谷氨酸摩尔质量浓度的异常参与了多种缺血缺氧视网膜疾病的病理过程过程.相关文献报道,实验性动物急性高眼压中视网膜谷氨酸水平明显增高[2]；慢性高眼压大鼠视网膜谷氨酸摩尔质量浓度升高与GLAST和GSmRNA表达下降有关[3]；视网膜缺血再灌注中谷氨酸摩尔质量浓度升高，可能是视网膜损伤的机制之一[4]；高糖诱导的大鼠视神经节细胞损伤也与谷氨酸的释放增多有关[5].

(2) 早产儿、低体重儿呼吸系统发育不完善，氧疗是临床治疗的重要手段.早产儿暴露于高氧环境中，视网膜血管发生痉挛缺血，到吸氧停止后，可产生新生血管和增殖性视网膜病变，严重者可导致视网膜脱离失明.出生后小鼠视网膜发育还未成熟，通过高氧刺激，可出现类似人类的ROP改变[6].通过实验动物模型研究高氧处理对视网膜谷氨酸的影响及其机制，探讨高氧导致视网膜损伤的原因具有一定的现实意义.

(3) 研究结果表明，高氧处理新生小鼠可导致视网膜损伤，检测发现损伤组视网膜谷氨酸摩尔质量浓度增加，过多的谷氨酸在细胞间隙蓄积结合谷氨酸受体产生兴奋性毒性是造成视网膜受损的原因之一.高氧导致的GLAST mRNA表达下降使细胞谷氨酸转运体GLAST减少，谷氨酸不能快速地摄入细胞内；高氧导致的GS mRNA表达下降使谷氨酸代谢为谷氨酰胺能力减弱，提示GLAST和GS mRNA表达下降是细胞外谷氨酸摩尔质量浓度增加的机制之一.高氧处理过程中谷氨酸的代谢是下一步拟研究的内容与方向.

[1] PROVIS J M.Development of the Primate Retinal Vasculature[J].Prog. Retin. Eye. Res.,2001,20(6):799-821.

[2] 王平宝，蒋幼芹，黄佩刚,等.兔实验性急性高眼压模型视网膜谷氨酸的变化[J].中华眼科杂志，2000,36(5)：378-380.

[3] 闫桂刚,王 华,王大博,等．慢性高眼压大鼠视网膜谷氨酸转运体GLAST mRNA 表达的改变[J].眼视光学杂志，2006,8(1)：9-14.

[4] 朱远军，金 敏，高宗银,等.葛根素对兔视网膜缺血再灌注损伤中谷氨酸浓度的影响[J].中国中医眼科杂志，2007,17(1)：32-34.

[5] 喻小龙，谭 钢，刘二华，等.罗格列酮对高糖诱导视网膜神经节细胞损伤的保护作用[J].眼科新进展，2013，33(2):101-105.

[6] 赵 勇,任 兵,高晓唯,等.TNP470治疗高氧诱导幼鼠视网膜病变的作用[J].国际眼科杂志,2007，7(4):965-968.

(责任编辑 陈炳权)

EffectandMechanismofGlutamateReleaseatHyperxiaInducedRetinalInjuryinNewbornMice

PENG Zhenyu1,2，GAO Ling1，PENG Xiangping3

(1.Department of Ophthalmology，the Second Xiangya Hospital of Central South University，Changsha 410011，China;2.Department of Ophthalmology，the People’s Hospital of Xiangxi Autonomous Prefecture，Jishou 416000，Hunan China;3.Medical College of Jishou University,Jishou 416000,Hunan China)

The concentration change and mechanism of glutamate at hyperxia induced retinal injury in newborn mice retinal injury are explored.The experimental group was put in 95% hyperxia environment to induce retinal damage,and the control groups in normal air.HE staining was used to observe retinal injury,ELIASA to detecte the glutamate (Glu) concentration,and reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) to analyze the expression of retinal glutamate transporter (GLAST) and glutamine synthetase (GS) mRNA.The results showed that,compared with control group,hyperxia treatment group with retinal injury showed the increased Glucontent,and decreased GLAST and GS mRNA expression.It thus can be concluded that hyperxia can lead to the increase of retinal glutamate in newborn mice,the mechanism of which was associated with decreased GLAST and GS mRNA expression.Glutamate increase may be one of the reasons for the hyperxia induced retinal injury.

hyperxia;glutamate;retina；newborn;mice

1007-2985(2014)02-0090-04

2013-12-26

彭振宇(1976-)，湖南保靖人，中南大学湘雅二医院硕士生，湘西自治州人民医院副主任医师，主要从事玻璃体与视网膜疾病研究

高 玲(1968-)，女，湖南怀化人，中南大学湘雅二医院教授，博士生导师，主要从事眼疾病的发病机制与诊疗研究.

R774.1

A

10.3969/j.issn.1007-2985.2014.02.020