丹参酮ⅡA保护脑梗死大鼠血脑屏障的机制研究

温 雅，祝春华，王力娜，季 辉，刘 莹(河北医科大学第二医院神经内科，河北 石家庄 050000)

·论著·

丹参酮ⅡA保护脑梗死大鼠血脑屏障的机制研究

温 雅，祝春华，王力娜，季 辉，刘 莹
(河北医科大学第二医院神经内科，河北 石家庄 050000)

目的探讨丹参酮ⅡA对大鼠脑梗死后血脑屏障的保护作用及其机制。方法线栓法建立大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)大鼠模型。实验采用随机分组(n=168)，分为假手术组、MCAO组、丹参酮ⅡA大剂量组、丹参酮ⅡA小剂量组。丹参酮ⅡA于术后立即腹腔注射，大鼠24h处死。采用Western Blot和反转录-聚合酶链反应测定claudin-5蛋白和IgG变化，激光共聚焦显微镜观察双重荧光标记的claudin-5和IgG在脑组织的分布，并观察神经功能、脑梗死体积和脑水肿。结果与假手术组比较，MCAO组claudin-5表达明显减少；大剂量丹参酮ⅡA能够显著上调claudin-5，明显改善神经功能，减轻脑水肿，减小梗死体积，减少IgG渗出，保护血脑屏障。结论大剂量丹参酮ⅡA通过上调claudin-5表达，维持血管内皮细胞紧密连接的完整性，对血脑屏障发挥保护作用，是丹参酮ⅡA治疗脑梗死的重要机制

脑梗死；血脑屏障；丹参酮

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.08.001

血脑屏障破坏是脑梗死后脑水肿形成的主要原因，是导致继发性脑损伤的重要机制之一[1]，而决定血脑屏障完整性的最主要结构是紧密连接蛋白。Claudin-5是紧密连接蛋白的代表成分，其水平代表了血脑屏障的完整性。增加claudin-5表达的药物能够有效保护血脑屏障完整性，减轻脑水肿[1-2]。丹参酮ⅡA是中药丹参的有效活性成分[3]，能够抑制炎症反应和细胞凋亡，广泛用于治疗心脑血管病等[4]。而丹参酮Ⅱ能否保护血脑屏障以及详细机制有待明确。本研究建立大鼠永久性大脑中动脉闭塞(middlecerebralarteryocclusion，MCAO)模型，观察丹参酮ⅡA对脑梗死后脑水肿和claudin-5表达的影响，探讨其对血脑屏障的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂

1.1.1 实验动物：成年雄性健康清洁级SD大鼠168只，体质量250～280g，由河北省实验动物中心提供。

1.1.2 试剂和仪器：兔抗claudin-5多克隆抗体(美国SantaCraz)；DYY-12型电泳仪(北京六一仪器厂)；Synergy-HT多功能酶标仪(美国Bio-Tek)；聚合酶链反应扩增仪(德国Eppendorf)；荧光定量聚合酶链反应仪7500(美国ABI)；OLYMPUSFV10-ASW激光扫描共聚焦显微镜(日本OLYMPUS)。

1.1.3 引物设计与合成：上海生物工程公司合成，引物序列如下。Claudin-5，上游5′-CACAGAGAGG-GGTCGTTGAT-3′，下游5′-ACTGTTAGCGGCAGTTT-GGT-3′；β-actin，上游5'-GCCATGTACGTAGCCAT-CCA-3′，下游5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组和模型：线栓法建立持续性大鼠右侧MCAO模型。随机将168只SD大鼠分为假手术组、MCAO组、丹参酮ⅡA大剂量(丹参酮ⅡA-H)组、丹参酮ⅡA小剂量(丹参酮ⅡA-L)组，每组42只。假手术组血管分离后不插线栓。丹参酮ⅡA组分别以20mg/kg和10mg/kg于MCAO手术后立即腹腔注射。

1.2.2 神经功能缺失评分：处死之前，单盲采用改良的Longa分级法进行行为学评分。0分，无缺陷；1分，不能伸展对侧前肢；2分，对侧前肢屈曲；3分，轻度向对侧转圈；4分，严重向对侧转圈；5分，向对侧跌倒(n=10)。

1.2.3 脑组织含水量测定：大鼠在手术后24h断头，迅速取脑。冠状切开去除额极，双侧取约2mm厚的脑组织，采用干湿法测定脑组织含水量，脑组织含水平=(脑组织湿质量-脑组织干质量)/湿质量×100%(n=8)。

1.2.4 脑梗死体积测定；各组大鼠在相应时间断头取脑，均匀切成5片冠状切片，浸入2% 2，3，5-氯化三苯基四氮唑溶液，37℃染色30min后4%多聚甲醛中固定24h。梗死体积百分比=(矫正梗死体积/非缺血侧半球体积)×100%(n=6)。

1.2.5Claudin-5表达和IgG荧光渗出：采用WesternBlot检测claudin-5蛋白表达(n=6)，采用反转录-聚合酶链反应检测claudin-5mRNA表达，以β-actin作为内参基因(n=6)。激光扫描共聚焦显微镜观察冰冻脑组织片内claudin-5及IgG的共表达并同时测定渗出IgG的强度(n=6)。

2 结 果

2.1 丹参酮ⅡA改善大鼠MCAO后的神经功能：MCAO组、丹参酮ⅡA-H组、丹参酮ⅡA-L组与假手术组比较，均有明显的神经功能障碍。与MCAO组相比，TanⅡA-H组的神经功能在24h得到明显改善(P<0.05)。TanⅡA-L组的神经功能评分虽然低于MCAO组，但差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

图1 各实验组术后24h神经功能评分(n=10)

*P<0.05与其他组比较(单因素方差分析)

Figure1Theneurologicaldeficitsat24hafteroperation(n=10)

*P<0.05vsothergroupsbyANOVA

2.2TanⅡA显著减轻患侧脑水肿：术后24h，与假手术组比较，其余3组患侧脑组织有明显的水肿(P<0.05)；与MCAO组相比，TanⅡA-H组患侧脑水肿得到明显改善(P<0.05)，TanⅡA-L组患侧脑水肿改善差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

GroupsWatercontentofipsilateralhemisphereSham⁃operated77．87±0．17MCAO83．21±0．12∗TanⅡA⁃L81．75±0．06∗TanⅡA⁃H78．60±0．05∗# F1．012 P<0．05

*P< 0.05vssham-operated group #P<0.05vsMCAO group byqtest

2.3 TanⅡA显著减小脑梗死体积：假手术组未见缺血病灶，MCAO组、TanⅡA-L组和TanⅡA-H组均有大小不等的缺血性病灶。TanⅡA-H组与MCAO组比较，缺血性病灶体积明显减小(P<0.05)。见表2。

GroupsInfarctvolumeMCAO51．00±0．75TanⅡA⁃L47．54±3．96TanⅡA⁃H28．57±1．07∗ F2．375 P<0．05

*P<0.05vsMCAO group byqtest

2.4 TanⅡA上调claudin-5表达：与假手术组比较，MCAO组脑缺血后24h时claudin-5蛋白表达水平明显下降；与MCAO组比较，TanⅡA-L和TanⅡA-H均能够显著上调claudin-5表达(P<0.05)。见表3。

GroupsClaudin⁃5proteinClaudin⁃5mRNASham⁃operated0．26±0．071．12±0．11MCAO0．13±0．010．60±0．13TanⅡA⁃L0．31±0．05∗1．39±0．28∗TanⅡA⁃H0．31±0．72∗1．44±0．32∗ F2．1052．331 P<0．05<0．05

*P< 0.05vsMCAO group byqtest

2.5 TanⅡA减少IgG荧光渗出：与MCAO组比较，TanⅡA-H能够显著减少IgG的渗出，而TanⅡA-L作用不明显。见表4。

GroupsImmunofluorescentintensityofIgGMCAO1811．16±185．25TanⅡA⁃L1607．52±177．40TanⅡA⁃H1168．72±160．04∗ F2．874 P<0．05

*P<0.05vsMCAO group byqtest

3 讨 论

血脑屏障结构包括血管内皮细胞和紧密连接蛋白、基底膜以及血管周围的星形胶质细胞的终足。紧密连接蛋白的作用是连接血管内皮细胞，是决定血脑屏障的完整性的关键性结构[1-3]。其中，claudin-5是最重要的贯穿紧密连接蛋白中的特殊蛋白，大量分布于脑血管内皮细胞[3-4]。

血脑屏障的完整性是保证脑组织内环境稳定的重要基础[5]。研究[4，6]证明，脑梗死后早期就引起血脑屏障结构破坏，使其通透性增加，是各种炎症介质、抗体、补体以及血浆蛋白等进入脑实质，引起脑水肿等一系列病理反应的基础。本研究结果显示，大鼠脑梗死后24h时，出现显著的神经功能障碍和脑水肿，血脑屏障完整性破坏，claudin-5表达明显减少。有研究[1]证明，claudin-5基因敲除后，相对分子质量小于800 000的物质能够顺利通过血脑屏障进入脑组织。而促进claudin-5表达的药物能够有效降低血脑屏障通透性[7-8]。

丹参酮ⅡA是从唇形科植物丹参的根中提取分离的二萜醌类化合物,为丹参中的有效成分。近年来研究发现丹参酮ⅡA不仅具有较强的抗菌、抗炎、抗肿瘤活性，还具有抗血小板聚集、抗血栓作用[9]。在脑梗死方面，研究证明丹参酮ⅡA分别通过抑制脑梗死后炎症反应和细胞凋亡等途径，能够有效减小脑梗死体积，减轻脑水肿，具有神经保护作用[10-12]。本研究结果发现，大剂量丹参酮ⅡA(20mg/kg)能够显著上调claudin-5蛋白和基因表达，减少大分子物质IgG渗出，减小脑梗死体积，减轻脑水肿，改善神经功能。

综上所述，丹参酮ⅡA通过上调claudin-5水平，维持血管内皮细胞紧密连接蛋白的完整性，降低血脑屏障的通透性，减轻脑水肿，是其治疗脑梗死的部分作用机制。但是，丹参酮ⅡA治疗脑梗死以及保护血脑屏障的详细机制仍需深入研究。

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(本文编辑：刘斯静)

MECHANISMOFTANSHINONEⅡAPROTECTINGBLOOD-BRAINBARRIERINFOCALCEREBRALISCHEMIAOFRATS

WENYa,ZHUChunhua,WANGLina,JIHui,LIUYing
(DepartmentofNeurology,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China)

ObjectiveThisstudyistoexploretheprotectiveroleandmechanismoftanshinoneⅡA(TanⅡA)fortheblood-brainbarrierinfocalcerebralischemiaofrats.MethodsMaleSprague-Dawleyratsweresubjectedtopermanentmiddlecerebralarteryocclusion(MCAO).Sprague-Dawleyrats(n=168)wererandomlydividedintosham-operatedgroup,MCAOgroup,TanⅡAhigherdosegroup(TanⅡA-H)andTanⅡAlowerdosegroup(TanⅡA-L).TanⅡAwasadministeredwithintraperitomealinjectionimmediatelyafteroperation,ratswereexecutedat24h.WesternBlot,RT-PCRandconfocalmicroscopewereusedtomeasureclaudin-5proteinandIgGexpressioninischemicbrain.Andtheneurologicaldeficits,brainwatercontentandinfarctvolumewereexplored.ResultsAt24hafterfocalcerebralischemia,claudin-5expressioninMCAOgroupdecreased.Claudin-5inTanⅡA-Hgroupsignificantlyup-regulated,andalsoitsneurologicdeficit,infarctvolumeandbrainwatercontentwerealleviatedcomparedwithMCAOgroup(P<0.05).ConclusionTanⅡA-Hprotectedblood-brainbarrierpermeabilitybyincreasingclaudin-5,whichmightbethemechanismoftreatingfocalcerebralischemia.

braininfarction;blood-brainbarrier;tanshinone

2014-04-02；

2014-07-07

温雅(1981-)，女，河北石家庄人，河北医科大学第二医院主治医师，医学硕士，从事脑血管疾病诊治研究。

R743.33

A

1007-3205(2014)08-0869-04