肝硬化大鼠中缝背核5-HT能神经元的表达

朱建忠，刘 冀，王国明，王 娟，隋月林，石葛明(.沧州医学高等专科学校解剖学和组织胚胎学教研室，河北 沧州 06000；.河北医科大学基础医学研究所神经生物学研究室，河北 石家庄 05007)

·论著·

肝硬化大鼠中缝背核5-HT能神经元的表达

朱建忠1，刘 冀1，王国明1，王 娟1，隋月林1，石葛明2
(1.沧州医学高等专科学校解剖学和组织胚胎学教研室，河北 沧州 061000；2.河北医科大学基础医学研究所神经生物学研究室，河北 石家庄 050017)

目的观察肝硬化大鼠中缝背核五羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)能神经元以及双标神经元的表达变化。方法健康雄性Wistar大鼠20只,分为模型组和对照组各10只，模型组大鼠经皮下注射CCl4结合饮用酒精14周，对照组皮下注射等剂量的生理盐水。应用5-HT免疫组织化学及5-HT复合NADPH-d免疫组织化学染色双标方法，观察中缝背核5-HT能神经元以及双标神经元的表达变化。结果与对照组相比，模型组大鼠中缝背核5-HT能神经元的数量未见明显变化，直径明显变小，模型组免疫反应阳性强度明显较对照组增强，神经元的光密度(0.54±0.04)vs(0.48±0.04)(P<0.01)；双标神经元未见明显变化。结论肝硬化影响了大鼠中缝背核5-HT能神经元。

肝硬化；大鼠；中缝背核；5-HT；神经元

五羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)是中枢神经系统一种重要的神经递质[1-2]，在神经系统分布广泛，参与调节机体的心理、情绪及行为等多种生理过程[3]。肝硬化晚期常因中枢神经系统(centralnervoussystem，CNS)的功能调节紊乱，引起肝性脑病的发生。研究[4-5]发现，肝硬化患者血液循环中5-HT明显增多，推测5-HT参与了肝性脑病的发生。也有研究[6]证实，大鼠中缝背核内有许多5-HT能神经元含有还原型辅酶Ⅱ(nicotinamideadenosinedenucleotidehydro-phosphoricacid,NADPH-d)活性。因此，本实验应用免疫组织化学以及免疫组织化学复合NADPH-d染色双标的方法，对肝硬化大鼠中缝背核5-HT能神经元及双标神经元的表达变化进行了研究，报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组:选用健康成年雄性Wistar大鼠20只，均购自河北省实验动物中心[清洁级，许可证号SCXK(冀)2008-1-003]，体质量150～200g，随机分成2组，即模型组和对照组，每组各10只。

1.2 肝硬化模型的制备：模型组给予60%CCl4溶液皮下注射，结合5%乙醇自来水溶液饮用；首次注射每只大鼠0.5mL/100g，以后每只0.3mL/100g，每周注射2次，共14周。对照组每周背部皮下注射等剂量的生理盐水，自来水饮用。

1.3 标本制备：所有大鼠经10%水合氯醛(600mg/kg)腹腔注射麻醉后，经左心室灌注固定，取脑后固定4h(4℃)。然后浸泡于30%蔗糖液(用0.1mol,pH7.4PBS溶解配制)中至组织块沉底，将所需部位行冠状位冰冻连续切片，片厚40μm，隔4张取1张，间断集片于0.1mol，pH7.4PBS中。

1.4 染色

1.4.1 5-HT免疫组织化学染色：正常血清室温孵育切片30min、1∶8 000兔抗鼠5-HT抗体4℃孵育48h、1∶500生物素化羊抗兔IgG室温孵育4h、1∶500辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素室温孵育1h、DAB显色5min；常规梯度脱水、透明、封片。阴性对照实验以PBS替代一抗。

1.4.2 5-HT免疫组织化学复合NADPH-d染色：将经5-HT免疫组织化学染色的切片，在0.1molPBS缓冲液漂洗2次后，浸入孵育液(孵育液组成，0.3%Tritonx-100,1g/LNADPH-Ⅱ,0.5g/LNBT)置于37℃ 60～90min，缓冲液终止反应，裱片制片。

1.5 数据采集：在每只动物的中缝背核处选取5张切片。应用IPP6.0图像分析系统，分析对照组和模型组大鼠的5-HT免疫反应阳性神经元的神经元数目及细胞平均直径和平均光密度值。应用奥林巴斯显微镜，于40倍物镜下计数1cm2范围的中缝背核背侧部(dorsalraphenucleus-dorsalpart,DRD)和腹侧部(dorsalraphenucleus-ventralpart,DRV)5-HT免疫组织化学复合NADPH-d染色的双标神经元数目；其中，DRD选取1个视野，DRV选取3个视野。

2 结 果

2.1 5-HT免疫组织化学染色结果：对照组大鼠脑内5-HT能神经元主要集中于中脑下丘阶段，在低倍镜下观察，可见位于中脑水管腹侧与两侧内侧纵束之间的多细胞聚集区；位于中脑水管腹侧的中缝背核5-HT能神经元整体形态呈喷泉样(图1A)；与对照组大鼠相比，模型组大鼠中缝背核5-HT能神经元在分布上未见显著区别，但免疫反应强度明显高于对照组大鼠(图1B)。与对照组相比，模型组5-HT能神经元的数量差异无统计学意义(P>0.05)，但直径明显减小(P<0.01)，免疫反应强度明显增强(P<0.01)。见表1。

2.2 5-HT免疫组织化学复合NADPH-d染色结果：在中脑中缝背核5-HT免疫组织化学复合NADPH-d染色的切片，双标神经元主要集中在DRD和DRV(图1C,D)。这2个中缝背核亚核团中的5-HT能神经元中，仅有部分5-HT能免疫反应阳性神经元为NOS阳性。与对照组相比，模型组DRD以及DRV，双标神经元平均数量所占5-HT能神经元比值差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

GroupsQuantityAveragediameter(μm)OpticaldensityControl104．04±25．9910．47±0．620．48±0．04Model101．46±24．18 9．76±0．440．54±0．04t0．2302．9533．354P>0．05<0．01<0．01

GroupsDRDDRVControl8．00±5．2032．33±16．01Model8．75±2．0625．75±9．54t0．4241．116P>0．05>0．05

DRD:dorsal raphe nucleus,dorsal part;DRV:dorsal raphe nucleus,ventral part

3 讨 论

5-HT能神经元主要分布于脑干中缝核群[7]。中缝背核是中枢神经系统中富含5-HT能神经元的一个重要核团，只有少量5-HT能神经元分布在中缝核以外的区域如脚间核、蓝斑等脑区。本研究结果显示，肝硬化大鼠中缝背核5-HT能神经元，除了数量变化不明显外，直径以及免疫反应强度均出现了明显的变化。提示肝硬化导致了中缝背核5-HT能神经元的改变，可能参与了肝性脑病的发生。中缝背核5-HT能神经元接受大脑其他部位的纤维投射[5]，并发出纤维投射到脑的其他部位[8-9]。因此，推测肝硬化除影响5-HT能神经元以外，同时还可能累及途经中缝背核的上行和下行的其他神经纤维和(或)某些其他核团及其释放的递质，提示中缝背核5-HT在肝硬化导致肝性脑病的过程中，似乎不是作为一个独立的递质体系在起作用，而可能是与其他神经递质共同发挥作用。

研究[6]发现，在大鼠的中缝核内有许多5-HT能神经元含有NADPH-d活性。因此，本研究利用免疫组织化学复合NADPH-d双标方法，结果发现肝硬化大鼠中缝背核双标神经元平均数量所占5-HT能神经元比值，与对照组比较差异无统计学意义。关于中缝背核内双标神经元的纤维投射及其生理功能尚不清楚。研究[10]发现，一氧化氮与5-HT之间在某些功能上存在联系。如内皮起源的舒张因子，能抑制大脑大血管对5-HT的收缩反应；硝普钠作为外源性一氧化氮的供体，能抑制5-HT摄取；另外，苯丙胺类衍生物，能够选择性地损毁中缝背核内侧和外侧5-HT神经元轴突，然而，一氧化氮合酶抑制剂或N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂能防止这种毒性，表明一氧化氮可能参与了这种毒害作用。对于肝性脑病的确切发病机制，有待进一步深入研究。(本文图见封二)

[1] 顾长海，王宇明.肝功能衰竭[M].北京:人民卫生出版社,2002：208-211.

[2] LEE JJ,KIM T,CHO WK,et al.Antithrombotic and antiplatelet activities of Soshiho-tang extract[J].BMC Complement Altern Med，2013，13:137.

[3] OGAWA M,KAWAGUCHI Y,MARUNO A,et al.Small serotonin-positive pancreatic endocrine tumors caused obstruction of the main pancreatic duct[J].World J Gastroenterol，2012，18(45):6669-6673.

[4] RENZI A,DEMORROW S,ONORI P,et al.Modulation of the biliary expression of arylalkylamine N-acetyltransferase alters the autocrine proliferative responses of cholangiocytes in rats[J].Hepatology，2013，57(3):1130-1141.

[5] MANN DA,OAKLEY F.Serotonin paracrine signaling in tissue fibrosis[J].Biochim Biophys Acta，2013，1832(7):905-910.

[6] JAKAB RL,COLLACO AM,AMEEN NA.Lubiprostone targets prostanoid signaling and promotes ion transporter trafficking,mucus exocytosis,and contractility[J].Dig Dis Sci,2012,57(11):2826-2845.

[7] CARVER CS,JOHNSON SL,JOORMANN J.Two-mode models of self-regulation as a tool for conceptualizing effects of the serotonin system in normal behavior and diverse disorders[J].Curr Dir Psychol Sci,2009,18(4):195-199.

[8] BAJAJ JS,THACKER LR,HEUMAN DM,et al.Cognitive performance as a predictor of hepatic encephalopathy in pretransplant patients with cirrhosis receiving psychoactive medications: a prospective study[J].Liver Transpl,2012,18(10):1179-1187.

[9] EBRAHIMKHANI MR,OAKLEY F,MURPHY LB,et al.Stimulating healthy tissue regeneration by targeting the 5-HT2β receptor in chronic liver disease[J].Nat Med,2011,17(12):1668-1673.

[10] SVEJDA B,KIDD M,GIOVINAZZO F,et al.The 5-HT(2B) receptor plays a key regulatory role in both neuroendocrine tumor cell proliferation and the modulation of the fibroblast component of the neoplastic microenvironment[J].Cancer,2010,116(12):2902-2912.

(本文编辑：赵丽洁)

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《河北医科大学学报》编辑部

EXPRESSIONOF5-HTNEURONSINDORSALRAPHEOFCIRRHOSISRATS

ZHUJianzhong1,LIUJi1,WANGGuoming1,WAGNJuan1,SUIYuelin1,SHIGeming2
(1.DepartmentofAnatomy,HistologyandEmbryology,CangzhouHighMedicalTrainingSchool,Cangzhou061000,China;2.DepartmentofNeurobiology,BasicMedicineInstitute,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China)

ObjectiveTostudytheexpressionof5-hydroxytryptamine(5-HT)anddouble-labeledneuronsindorsalrapheofcirrhosisrats.MethodsThehealthymaleWistarratsweredividedintomodelandcontrolgroups(n=10).Within14weeks,modelgroupratsweresubcutaneouslyinjectedbyCCl4plusdrinkingethonal.Controlgrouprats

subcutaneouslyinjectionofsodiumchloride.5-HTimmunohistochemistryand5-HTimmunohistochemistrycombinedwithNADPH-dstainingwereusedtodetecttheexpressionof5-HTanddouble-labeledneuronsindorsalrapheofrats.ResultsTheaveragediameter5-HTneuronsindorsalraphedecreasedsignificantlyinthemodelgroupcomparedwiththatofcontrolgroup.Theopticaldensityvalueof5-HTneuronsindorsalraphedincreasedsinificantlyinthemodeofgroup(0.54±0.04)comparedwiththatofcontrolgroup(0.48±0.04)(P<0.01).Thequantityof5-HTneuronsandthedouble-labeledneuronsindorsalraphehasdnosignificantdifferencebetweentwogroups.ConclusionCirrhosisinfluenced5-HTneuronsindorsalrapheofrats.

cirrhosis;rat;dorsalraphenucleus;5-HT;neuron

2013-12-30；

2014-03-29

朱建忠(1978-)，男，河北唐海人，沧州医学高等专科学校讲师，医学硕士，从事人体解剖学教学及科学研究。

R322．81

A

1007-3205(2014)06-0625-03

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.06.003