阿魏酸酯酶A的基因克隆与表达及其水解产物的纯化

曾妍，龚燕燕，邬敏辰，殷欣，唐存多

1 江南大学药学院，江苏 无锡 214122

2 江南大学无锡医学院，江苏 无锡 214122

3 江南大学生物工程学院，江苏 无锡 214122

阿魏酸酯酶 (Feruloyl esterase, E.C.3.1.1.73)是羧酸酯水解酶的一个亚类，可以水解植物细胞壁中多糖与阿魏酸连接的酯键，并释放出游离的阿魏酸单体或二聚体。阿魏酸酯酶的来源比较广泛，目前已有许多关于微生物来源的阿魏酸酯酶的分离纯化、基因克隆和异源表达等[1-3]的报道。Mathew等[4]对黄柄曲霉Aspergillus flavipes进行了液体深层发酵，获取了阿魏酸酯酶，最高酶活可达 6.82 U/mL。张帅兵等[5]克隆了黑曲霉Aspergillus niger的A型阿魏酸酯酶基因，并在毕赤酵母中实现了异源表达，酶活为16.6 U/mL。在食品和医药领域中，利用阿魏酸酯酶来降解植物细胞壁中的阿魏酸酯键，可以得到有药用价值和保健功能的游离阿魏酸[6-7]。阿魏酸是桂皮酸的一种衍生物，其化学名称为4-羟基-3-甲氧基肉桂酸，也是一种天然的抗氧化剂，对心血管疾病、糖尿病、老年痴呆症和肿瘤等疾病有治疗作用[8-9]。目前阿魏酸的生产方法主要包括化学合成法和碱解法，但这两种方法均存在一定的缺陷[10]。化学合成法反应步骤多、周期长；碱解法的原料谷维素在米糠中含量低，产量受限；此外，这两种方法都具有污染性，因此酶法生产阿魏酸成为近年来研究的热点[11]。然而，酶解液是一个复杂的体系，从中分离出阿魏酸仍比较困难。寻找合适的阿魏酸纯化工艺也是实现阿魏酸工业化生产所需要突破的一个瓶颈。

米曲霉Aspergillus oryzae安全性高、不产毒素，应用于食品工业历史悠久[12]，因此从米曲霉中提取的阿魏酸酯酶应用于药品、食品等行业安全性也很高。另外，目前国内外均未见关于米曲霉阿魏酸酯酶A基因克隆与表达的研究报道。本研究利用购买的具有产阿魏酸酯酶能力的A. oryzaeCICC 40186菌株，结合生物信息学分析的手段，借助RT-PCR技术克隆了编码米曲霉阿魏酸酯酶A (AorFaeA) 的cDNA片段，并实现了其在毕赤酵母GS115中的分泌表达。此外，研究了利用大孔树脂从小麦麸皮酶解液中分离阿魏酸的工艺条件。本研究为阿魏酸的酶法“绿色生产”及应用奠定了坚实的理论基础。

1 材料与方法

1.1 菌株和载体

米曲霉A. oryzae购自中国工业微生物菌种保藏中心，编号为CICC40186；大肠杆菌Escherichia coliJM109和 DH5α、毕赤酵母Pichia pastorisGS115和表达载体 pPIC9K为本实验室保存；克隆载体pUCm-T购自上海Sangon生物工程有限公司；GS115/Aoxyn11A由本实验室构建与保存[13]。

1.2 工具酶、引物和试剂

限制性内切酶、T4 DNA连接酶和Taq酶等工具酶购自大连 TaKaRa生物工程有限公司；PCR引物由上海Sangon公司合成；PCR产物纯化试剂盒、DNA marker、蛋白质 marker、YNB、生物素、酵母粉、蛋白胨、geneticin G418、UNIQ-10柱式 Trizol总 RNA抽提试剂盒和EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit购自上海Sangon公司；标准反式阿魏酸与阿魏酸甲酯购自盐城朗德化学有限公司；大孔吸附树脂购自河北沧州宝恩化工有限公司；其他化学试剂均为国产或进口分析纯。

1.3 培养基

种子活化培养基：2%玉米粉，3%豆饼粉，3% KH2PO4，1% CaCl2，1% MgSO4；诱导培养基 (用于总 RNA的提取)：0.9% NaNO3，0.05%KH2PO4，0.05% MgSO4，0.4%酵母提取物，20%麸皮提取液；LB、YPD、MD、BMGY和BMMY培养基参考Invitrogen公司的Multi-CopyPichiaExpression Kit操作手册。

1.4 方法

1.4.1 引物设计及合成

根据A. oryzaeRIB40菌株基因组中阿魏酸酯酶 A的基因序列(GenBank Accession No.XM_001818700)和表达质粒 pPIC9K 上的多克隆位点，设计出一对扩增编码 AorFaeA成熟肽cDNA的特异性上下游引物，向上游引物FaeA-F中引入EcoRⅠ酶切位点，向下游引物 FaeA-R中引入NotⅠ酶切位点，引物由上海 Sangon公司合成 (表 1)。

表1 扩增目的基因AorfaeA的PCR引物Table 1 PCR primers for amplification of target gene AorfaeA

1.4.2 AorFaeA成熟肽编码基因的克隆

将斜面保藏的A. oryzae菌种接种于种子活化培养基，于30 ℃、220 r/min条件下培养24 h，以2%的接种量转至诱导培养基中，于同样条件下培养24 h后收集菌体，用UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒提取A. oryzae的总RNA。以总RNA为模板，参照RT-PCR试剂盒说明书，以oligo (dT)为引物逆转录合成 cDNA的第一条链。然后以cDNA的第一链为模板，以FaeA-F为上游引物，依次以oligo (dT)-M13 Primer M4和FaeA-R为下游引物，进行两轮PCR，扩增出编码AorFaeA成熟肽的cDNA。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的条带。将回收的产物与 pUCm-T连接，转化E. coliJM109，送上海Sangon测序，测序正确的重组质粒命名为pUCm-T-AorfaeA。

1.4.3 AorFaeA成熟肽编码基因在毕赤酵母中的表达

测序正确的重组质粒 pUCm-T-AorfaeA经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切，将目的基因连接至表达质粒pPIC9K，转化E. coliDH5α，经测序鉴定，重组表达质粒命名为 pPIC9K-AorfaeA。pPIC9K-AorfaeA用SalⅠ线性化，电转化毕赤酵母GS115，涂布于MD平板上筛选重组子，取MD平板上生长良好的菌落用牙签点种至含0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL G418的YPD平板上，筛选抗4.0 mg/mL G418的毕赤酵母重组子，命名为GS115/AorfaeA。分别提取 GS115/AorfaeA及 GS115/9K基因组DNA，利用通用引物5'-AOX和3'-AOX进行PCR鉴定。重组酵母 GS115/AorfaeA的诱导表达及SDS-PAGE分析参见文献[14]和[15]。

1.4.4 重组阿魏酸酯酶 (reAorFaeA) 的分离纯化与活性测定

将诱导表达的发酵液加入固体(NH4)2SO4粉末至80%饱和度，10 000 r/min离心10 min，收集沉淀复溶于一定体积的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH 6.0)，经超滤浓缩后过凝胶柱Sephadex-75，收集洗脱峰用于酶活测定，并利用Bradford法测定蛋白含量[16]。

reAorFaeA酶活测定参照 Zhang等[17]的方法略做改动。取900 μL用0.1 mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH 6.0)配制的1 mmol/L的阿魏酸甲酯于 EP管中，45 ℃预热 10 min，加入 100 μL稀释适当倍数的酶液，准确反应 10 min后加入400 μL冰乙酸终止反应，立即混匀进行高效液相色谱 (HPLC) 分析，在 320 nm下测定经reAorFaeA水解后产物中阿魏酸的释放量。以预先在酶溶液中加入400 μL冰乙酸，再加底物溶液的反应物为对照。在上述反应条件下，每分钟产生 1 μmol阿魏酸所需的酶量定义为一个酶活性单位 (U)。

色谱条件：戴安 UltiMate-3000高效液相色谱仪，C18 5 μm ODS 反相色谱柱(260 mm×4.6 mm)，柱温30 ℃，进样量 20 μL。流动相组成为 A：100%甲醇，B：1%乙酸(V/V)，一步梯度洗脱，0 min，50% B、10 min，20% B，UV检测波长为320 nm，洗脱流速为1 mL/min。

1.4.5 阿魏酸粗提液的制备

按 1.4.3诱导表达重组酵母 GS115/AorfaeA[18]和GS115/Aoxyn11A，分别获得reAorFaeA和重组木聚糖酶 (reAorXyn11A)，reAorXyn11A的酶活按文献[13]的方法测定。准确称取0.5 g去淀粉麸皮于100 mL锥形瓶中，加入8 mL reAorFaeA酶液(约16.88 U)和0.5 mL reAorXyn11A酶液(约72.5 515 U)，用0.1 mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH 5.0)定容至30 mL，于40 ℃酶解10 h，煮沸5 min灭酶活，离心收集上清液即为阿魏酸粗提液。

1.4.6 大孔树脂的预处理

将大孔树脂置于容器中，用95%乙醇浸泡24 h使其充分溶胀，以乙醇湿法转移柱内(层析柱：2 cm×30 cm)继续用乙醇流动清洗，至1份乙醇加3份水不产生白色浑浊，再用清水冲洗至无醇味，备用。

1.4.7 静态吸附解吸

选择D-101、HPD-100、HPD-300、HP-20和AB-8五种型号树脂 (表2)，以阿魏酸吸附量和解吸率为标准，筛选最适树脂。称取处理好的树脂各1 g，分别加入所制备的阿魏酸粗提液50 mL，于25 ℃、120 r/min恒温振荡摇床上吸附24 h，测定上清液中阿魏酸的含量。用去离子水洗涤树脂后，加入95%乙醇50 mL，于25 ℃、120 r/min恒温振荡摇床上解吸附24 h，测定解吸液中阿魏酸的含量，计算各树脂的吸附量和解吸率。

1.4.8 大孔树脂纯化工艺

室温下，树脂装填量为50 mL，高度为15 cm。将阿魏酸粗提液浓缩至浓度为0.1 mg/mL，取10 mL上柱静置吸附2 h，水洗柱子每1个柱体积(BV) 收集一份水洗液，检测水洗液中还原糖和阿魏酸的含量，还原糖和阿魏酸的测定分别采用3,5-二硝基水杨酸 (DNS)法和HPLC法。至流出液中无还原糖时，用洗脱液洗脱，定量收集、测定洗脱液中阿魏酸的质量浓度，并计算回收率。洗脱液进行减压浓缩、干燥，测定总固物重量，同时计算阿魏酸粗提液总固体物中阿魏酸的质量分数和洗脱液总固体物中阿魏酸的质量分数（即纯度）。阿魏酸的回收率 (%) = (洗脱液中阿魏酸的质量浓度×洗脱液体积) / (粗提液中阿魏酸的质量浓度×粗提液体积) ×100%；阿魏酸的纯度 (%) = (洗脱液中阿魏酸的质量浓度×洗脱液体积) /洗脱液总固体质量×100%。

2 结果与分析

2.1 AorFaeA成熟肽编码基因的克隆及表达质粒的构建

以A. oryzae的总RNA为模板，FaeA-F分别和oligo (dT) -M13 Primer M4、FaeA-R为引物按照1.4.2中的方法进行两轮RT-PCR扩增，PCR产物经 1%琼脂糖凝胶电泳分析，第一轮 PCR在约1 000 bp处出现一条特异性条带(图1，泳道1)，第二轮PCR在约800 bp位置处出现一条特异性条带(图 1，泳道 2)，其大小与预期的相符。将目的产物割胶回收后与质粒 pUCm-T连接，转化E. coliJM109获得重组质粒，将重组质粒送上海Sangon公司测序。测序正确的重组质粒命名为pUCm-T-AorfaeA。结果表明，目的基因长度为783 bp，编码260个氨基酸。Blast分析结果表明该序列与黑曲霉Aspergillus niger faeA(GenBank Accession No. ADI70526.1)的序列同源性为 71%，与土曲霉Aspergillus terreusNIH2624faeA(GenBank Accession No.XP_001217493.1) 的序列同源性为 71%，与塔宾曲霉Aspergillus tubingensisfaeA(GenBank Accession No. CAA70511.1) 的序列同源性为74%。将重组质粒 pUCm-T-AorfaeA用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切及割胶回收，与经同样双酶切后回收的质粒pPIC9K连接，转化E.coliDH5α，筛选获得重组质粒 pPIC9K-AorfaeA，将重组质粒 pPIC9K-AorfaeA送上海 Sangon公司测序，测序结果与预期的一致。

图1 AorfaeA PCR产物电泳图Fig. 1 Electrophoretic profile of PCR products of AorfaeA. M: DNA marker; 1: the first round of PCR product; 2: the second round of PCR product.

2.2 AorfaeA基因在毕赤酵母中的表达

参考Multi-CopyPichiaExpression Kit操作手册，以及陈小芳等[19]筛选高拷贝重组子所采用的方法，转化子的拷贝数与其抗G418的能力有关 (如 0.5 mg/mL G418对应于 1–2个拷贝)，通过筛选抗高浓度 G418的酵母即可获得高拷贝转化子。以筛选到的抗4.0 mg/mL G418高拷贝重组毕赤酵母 GS115/AorfaeA的基因组为模板，用5'-AOX和3'-AOX引物进行PCR检测，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。结果显示以GS115/AorfaeA基因组为模板的PCR产物在约1 300 bp和2 100 bp处有两条特异性的条带(图2，泳道1)，而以GS115/9K基因组为模板的PCR产物在500 bp和2 100 bp处出现DNA条带(图2，泳道 2)，结果表明目的基因AorfaeA已成功整合入 GS115基因组内。挑取几个高拷贝的重组子按照 Multi-CopyPichiaExpression Kit操作手册中的方法进行诱导表达，筛选到一个产酶活性最高的GS115/AorfaeA重组子，其发酵上清液的酶活为2.11 U/mL，SDS-PAGE分析条带不唯一(图3，泳道 1)，发酵上清液经硫酸铵沉淀及凝胶层析纯化后，SDS-PAGE分析得到一条清晰的条带(图3，泳道2)，纯化后的酶液比酶活为58.35 U/mg，相比于Koseki等[20]在毕赤酵母中表达的泡盛曲霉Aspergillus awamoriAwfaeA的酶活(9.01±0.89) U/mg达较高水平。SDS-PAGE的结果显示reAorFaeA的表观分子量约为39.0 kDa，明显大于其理论分子量，用 NetNGlyc 1.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/) 对翻译后加工的 N糖基化位点进行预测，结果表明reAorFaeA氨基酸序列中含有两个潜在 N-糖基化位点，从而使得 reAorFaeA的表观分子量较其理论分子量有所增大。

图2 重组毕赤酵母GS115/AorfaeA的PCR鉴定Fig. 2 Identification of recombinant Pichia pastoris GS115/AorfaeA by PCR. M: DNA marker; 1: PCR product of GS115/AorfaeA; 2: PCR product of GS115/9K.

图3 表达产物SDS-PAGE分析Fig. 3 SDS-PAGE profile of expressed products. M:protein marker; 1 and 2: the expression products of GS115/AorfaeA unpurified and purified, respectively.

2.3 不同大孔树脂对阿魏酸的吸附量和解吸率的测定

因为阿魏酸为弱极性物质，相对于强极性大孔吸附树脂，其在非极性或弱极性大孔树脂上的吸附和解吸效果均较好[21]。按照1.4.7中的方法测定5种大孔树脂对阿魏酸粗提液中阿魏酸的吸附量和解吸率，结果显示HPD-300型大孔树脂的吸附量和解吸率均较高 (表 3)，通过比较这几种树脂的物理性质 (表2)，发现HPD-300型大孔树脂的比表面积较大，而较大的比表面积有利于酚酸类物质在树脂表面形成更加有序的排列，增加吸附过程中的氢键作用和π-π作用位点，从而提高大孔树脂对酚酸类物质的选择性。故选择 HPD-300型大孔树脂用于纯化阿魏酸的工艺研究。

表2 各类大孔树脂物理性质Table 2 Physical properties of macroporous resins

表3 静态吸附解吸结果Table 3 Static adsorption analytic results

2.4 洗脱液浓度对阿魏酸洗脱效果的影响

分别将10 mL处理好的阿魏酸粗提液上柱后静置吸附2 h，用去离子水进行洗涤除去多糖等杂质，当水洗液为4 BV时流出液中不含有还原糖，经HPLC检测，流出液中均不含有阿魏酸。然后分别选用30%、50%和70%浓度的乙醇溶液以l.0 mL/min的流速进行洗脱，每l BV收集一份洗脱液，共收集7 BV，分别置于旋转蒸发仪中蒸干，复溶于10 mL乙醇中，测量其中阿魏酸的含量。结果如图4A所示。由图4A可见30%的乙醇不易将阿魏酸洗脱下来，另外，70%乙醇洗脱液在洗脱时颜色较深，表明过高浓度的乙醇会将色素等杂质一并洗脱，因此宜选择50%乙醇溶液作为洗脱液。

2.5 洗脱液流速对阿魏酸洗脱效果的影响

分别采用 0.5 mL/min、l.0 mL/min和2.0 mL/min的流速对树脂进行洗脱，每l BV收集一份洗脱液，共收集7 BV，分别置于旋转蒸发仪中蒸干，复溶于10 mL乙醇中，测量其中阿魏酸的含量。结果如图4B所示。由图4B可见在一定流速范围内，流速越慢，洗脱效果越好。这可能是因为洗脱液流速越慢，越有利于树脂中阿魏酸解吸于洗脱液中。在 0.5 mL/min和 l.0 mL/min的洗脱流速下，阿魏酸的洗脱量较大，洗脱效果差别不大，4 BV洗脱液可洗脱完全，从缩短生产周期的角度出发，选择l.0 mL/min的流速进行洗脱。

2.6 验证试验

室温下，树脂装填量为50 mL，将阿魏酸粗提液浓缩至0.1 mg/mL，上样量为10 mL，静置吸附2 h，然后用4 BV去离子水冲洗以除去还原糖等杂质，用50%乙醇溶液以1.0 mL/min流速进行解吸，收集洗脱液4 BV，旋转蒸发浓缩，真空低温干燥成粉末，称重为8.72 mg，阿魏酸的纯度为10.55%，回收率为92%。而纯化前粗提物总固体物中阿魏酸的质量分数为0.13%，纯化倍数达到了 81.2，表明采用大孔吸附树脂纯化小麦麸皮中阿魏酸效果良好。

图4 洗脱液浓度及洗脱液流速对阿魏酸洗脱效果的影响Fig. 4 Effects of different concentrations of ethanol and flow speeds on elution of ferulic acid. (A) Change of ferulic acid concentration with different ethanol contents. (B) Change of ferulic acid concentration with different flow speeds.

3 讨论

本研究首次成功实现了米曲霉AorfaeA在P. pastorisGS115中的分泌表达，以阿魏酸甲酯为底物，其发酵上清液的粗酶活可达到2.11 U/mL，reAorFaeA经硫酸铵沉淀及凝胶层析纯化后，比酶活为58.35 U/mg。经SDS-PAGE检测reAorFaeA的表观分子质量约为39.0 kDa，明显大于其理论分子量。由于毕赤酵母表达体系可以对蛋白质进行糖基化修饰作用[22]，并且经NetNGlyc 1.0预测表明reAorFaeA氨基酸序列中含有两个潜在N-糖基化位点，因此推测reAorFaeA可能是经过糖基化修饰后的蛋白，使得其表观分子量大于理论分子量。

José等[23]研究了醇提水沉法，活性炭吸附法和聚乙烯吡咯烷酮 (PVPP) 吸附法3种方法纯化阿魏酸，醇提水沉法步骤复杂，需要多步沉淀，回收率为 57%；活性炭吸附分离阿魏酸，回收率为66%，可除去大部分色素，但活性炭的再生能力差，且分离过程中使用乙酸乙酯等有机溶剂，对环境有污染；PVPP纯化阿魏酸其回收率较低，为 51.8%。大孔树脂与其他天然吸附剂相比具有吸附性强、解吸附容易、可反复使用、流体阻力小、价格便宜、操作简单，抗污染能力强等优点[24]。特别是其孔径和孔度大小、比表面积、极性等性能都可以人为控制调节，供任意选择，在对天然产物进行大孔树脂纯化后，可以去除大部分糖类和水溶性杂质。本研究探索了利用大孔树脂从阿魏酸粗提液中纯化阿魏酸的工艺，基于测定出的不同树脂对阿魏酸的吸附量和解吸率，本研究选用HPD-300型大孔树脂探索从阿魏酸粗提液中纯化阿魏酸的工艺条件，确定了最佳纯化条件为：上样量10 mL，静置吸附2 h，用4 BV去离子水冲洗以除去还原糖等杂质，用4 BV 50%的乙醇溶液以1.0 mL/min流速进行解吸，纯化后阿魏酸的回收率为92%，纯度为10.55%，较阿魏酸粗提液纯化了81.2倍。

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