不同载体用于人卵裂期胚胎玻璃化冷冻的初步研究

黄绮云 柳倩茹 黄建洲 池霖生 张静雯

不同载体用于人卵裂期胚胎玻璃化冷冻的初步研究

黄绮云 柳倩茹 黄建洲 池霖生 张静雯

目的 比较不同载体用于人卵裂期胚胎玻璃化冷冻的效果。方法 选择冰珠、自制叶片、冷冻环这三种载体, 分别用于人卵裂期胚胎玻璃化冷冻后移植, 比较不同组合的复苏率、临床妊娠率、植入率。结果 冰珠组的复苏率、妊娠率、植入率为明显低于自制叶片组和冷冻环组, 差异具有统计学意义(P＜0.05)；自制叶片组和冷冻环组的复苏率、妊娠率、植入率差异无统计学意义(P＞0.05)。结论 冷冻载体选择自制叶片和冷冻环均可以取得较满意的冷冻效果, 其中自制叶片的成本更低, 所以应用自制叶片于人卵裂期胚胎玻璃化冷冻效果好且更经济。

载体；冷冻保护剂；人卵裂期胚胎；玻璃化冷冻

目前保存生育功能的方法中, 冷冻胚胎是唯一成熟的方法。冷冻胚胎不仅可以保存胚胎资源, 还可以提高各取卵周期的妊娠率, 相比较常规冷冻方法, 玻璃化冷冻具有耗时短、仪器相对经济、胚胎的复苏率较高等优点, 因此在临床上应用较多［1］。本文通过选择冰珠、自制叶片、冷冻环这三种载体,应用于人胚胎玻璃化冷冻后进行解冻复苏, 比较不同载体用于人卵裂期胚胎冷冻的效果, 为临床上冷冻载体的选择提供一定的参考依据。报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2012年9月～2013年2月在佛山市妇幼保健院生殖中心行体外受精一胚胎移植(IVF -ET)或单精子卵母细胞浆内注射(ICSI)的患者, 于取卵后第3天对移植后剩余的可利用胚胎进行冷冻。选择390个细胞, 随机分为三组, 每组130个, 所选胚胎均为Ⅰ～Ⅱ级胚胎。冷冻保护剂为Onigio玻璃化冷冻试剂盒。冷冻载体：①冰珠：体积10 μl, 不需要专门制作。②自制叶片：取常规0.25 ml麦管1支,用手术剪将麦管纵向剪开, 一剖为二, 取其中一半修剪成2～3 mm的叶片。③冷冻环：由美国Hamption Research公司提供的HR-4-963。

1.2 方法 冷冻方法：Onigio玻璃化冷冻试剂盒使用前从冰箱拿到室温度20～25℃复温30 min,所有冷冻步骤均在室温下进行。胚胎在基础液BS中1 min, 然后转入预处理液ES(含有7.5%乙二醇和7.5%二甲基亚砜)3～8 min,镜下观察胚胎细胞皱缩恢复至原体积, 再转入玻璃化冷冻液VS中平衡30～50 s。用冷冻载体装载胚胎后,迅速投入液氮中冷冻。

载体使用方法：①冰珠：用微量移液器将经过冷冻保护剂处理过的胚胎和溶液一并吸出后迅速滴入液氮, 控制总体积在10μl, 胚胎连同溶液在液氮中形成1个小冰珠并沉入液氮底部, 用消毒镊子取出冰珠置于保存管。②自制叶片：用拉细后的吸管将经过冷冻保护剂处理过的胚胎轻轻吹入自制叶片表面距离叶片末端2～3 mm处, 控制总体积在1～2μl, 之后迅速将环置于液氮中, 并用配套工具把环置于保存管。③冷冻环：先让冷冻环浸泡冷冻溶液后取出, 使环上粘附部分冷冻溶液, 再用拉细后的吸管将经过冷冻保护剂处理过的胚胎轻轻吹入冷冻环内, 控制总体积在1～2 μl,之后迅速将环放入液氮中浸泡, 并用配套工具把环置于保存管［2］。

胚胎解冻方法：复苏时胚胎从液氮中取出后, 迅速移至37.0℃的1.0 mol/L蔗糖的复苏液VS1中5 s, 室温下0.5 mol/L蔗糖复苏液VS2中10 s, 0.25 mol/L蔗糖复苏液WS3中20 s,再移入0.58 mol/L蔗糖复苏液WS4-1和WS4-2中各3 min,转入胚胎培养液待移植。患者的平均年龄是32.4岁。

1.3 统计学方法 本文采用SPSS17.0统计分析软件对研究数据进行统计分析, 计数资料采用χ2检验, 以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

冰珠组的复苏率、妊娠率、种植率为明显低于自制叶片组和冷冻环组, 差异具有统计学意义(P＜0.05)；自制叶片组和冷冻环组的的临床妊娠率、种植率差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 不同载体的冷冻效果比较［n, n(%)］

3 讨论

人卵裂期胚胎玻璃化冷冻成功的关键在于降温速率的提高, 而冷冻体积的缩小对降温起决定性作用［3］。冷冻环是尼龙制成的, 由于其体积缩小到1～2μl, 所以可以有效提高冷冻胚胎的复苏率、妊娠率和种植率, 但体积小使得操作范围也很小, 增加了显微镜下操作难度, 对操作人员的技术有一定的要求, 此外冷冻环大约300元/人, 相对昂贵。自制叶片由普通麦管制成, 成本很低且对胚胎没有毒性作用, 同时在显微镜下也比冷冻环更好操作, 可以放置多点, 操作便捷, 只要不会晃动剧烈, 不丢失胚胎, 就可以轻松控制体积在1～2μl内［4］。

本文研究结果显示, 冰珠组的复苏率为75.3%明显低于自制叶片组90.8%和冷冻环组的92.3%(P＜0.05), 自制叶片组和冷冻环组的临床妊娠率、种植率差异无统计学意义(P＞0.05)。说明冷冻载体选择自制叶片和冷冻环均可以取得较满意的冷冻效果。由于自制叶片的成本更低, 价格更容易被患者接受, 所以自制叶片应用于人卵裂期胚胎玻璃化冷冻效果好且更经济, 值得在临床上大力推广。

［1］ 刘本伟, 陈松林, 田永胜, 等.不同抗冻剂对牙鲆胚胎毒性研究以及玻璃化颗粒冷冻保存方法的应用.中国水产科学, 2007, 14(5): 733-742.

［2］ 巩晓芸, 龙梅, 胡泊, 等.冷冻载体对扩张期囊胚解冻结局的影响.中国组织工程研究, 2012, 16(40): 7470-7474.

［3］ 覃颖, 李慕军.卵巢组织玻璃化冷冻保存和移植的研究进展.中国组织工程研究, 2012, 16(18): 3411-3416.

［4］ 黄佩龙, 张绍志, 虞效益, 等.玻璃化冻存对羊软骨细胞的影响.浙江农林大学学报, 2011, 28(2): 269-274.

2014-04-18］

佛山市科技攻关项目(项目编号：201308003)

528000 佛山市妇幼保健院生殖中心

黄绮云