吉林松原地区CD36基因单体型与2型糖尿病的相关性研究

姚庆春 杨秀丽 郑寿焕 李金姬

吉林松原地区CD36基因单体型与2型糖尿病的相关性研究

姚庆春 杨秀丽 郑寿焕 李金姬

目的 对吉林松原郭尔罗斯自治县蒙古族和汉族人群中2型糖尿病(T2MD)患者CD36内含子3(intron 3)［TG］重复序列基因多态性分布情况进行研究, 探讨该基因多态性与2型糖尿病的相关性。方法 应用 PCR和直接测序法对40例正常组和193例2型糖尿病患者CD36内含子3 ［TG］重复序列基因多态性进行分析。结果 ①CD36内含子3 ［TG］重复序列有5种单体型, 即［TG］重复次数为11、12、13、15、16次。②正常组与2型糖尿病患者之间CD36内含子3 ［TG］重复序列各种单体型及基因型分布差异无统计学意义(P>0.05)。③蒙古族与汉族之间CD36内含子3 ［TG］重复序列各种单体型及基因型分布差异无统计学意义(P>0.05)。④CD36内含子3 ［TG］重复序列13次的单体型及基因型在蒙古族人群中正常组与2型糖尿病患者之间分布差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 CD36内含子3 ［TG］重复次数13次的单体型是松原蒙古族发生2型糖尿病的危险基因。

2型糖尿病；CD36；基因单体型

糖尿病是以高血糖为主要特征的内分泌代谢性疾病, 随着社会进步和生活方式的改变, 糖尿病的发病率越来越高, 2000年全球糖尿病患者 2.85亿, 估计到2030年全球将近5亿糖尿病患者, 其中中国约占全球的1/3。遗传因素在糖尿病的发生发展中占有重要的地位, CD36是一种多功能的清道夫受体, 与脂质代谢及动脉硬化的发生有关, 可激活细胞释放前炎症反应性细胞因子、白介素等［1］。作者对吉林松原前郭尔罗斯自治县蒙古族与汉族的健康人群和2型糖尿病患者之间CD36内含子3 ［TG］重复序列多态性在分布频率进行研究, 旨在探讨该基因多态性与2型糖尿病的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 随机选取在本院健康体检者40名：蒙古族23名、汉族17名, 年龄(45.7±17.9)岁作为正常对照组,临床和实验室检查均正常, 排除肝、肾、内分泌和心脑血管疾病。选取2004年12月~2012年12月在本院内分泌科住院的T2DM患者193例(蒙古族86例、汉族107例), 年龄(54.0±12.1)岁作为T2DM组。T2DM诊断依据1999年WHO制定的诊断标准。所有受检对象均为吉林松原前郭尔罗斯自治县地区无血缘关系个体。均签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 基因组DNA提取 采用Promega公司生产的Wizard@ Genomic DNA Purification Kit提取DNA。取被受检者肘静脉血2 ml到加有EDTA抗凝剂的真空采血管中, 并立刻颠倒混匀, 置于离心机中3000转离心10 min, 取300 μl白细胞加入到1.5 ml离心管中, 按照细胞裂解、核裂解、RNA去除、沉淀蛋白质、析出DNA、清洗DNA、水化DNA的过程分别加入试剂, 进行DNA的提取。所得DNA经紫外分光光度计定量,并置于-70℃保存备用。

1.2.2 PCR扩增基因片段 根据GenBank中所报告的序列设计CD36基因引物, 采用北京华美公司合成的引物：上游引物：5’ -ATTTATAAAAGAAGTTGCAC- 3’ 下游引物：5,-GTTTACCTACAATTTAATAA- 3’ ；PCR扩增体系(50 μl):包括5×Green GO Taq Buffer 10 μl, MgCl22 μl, dNTP 1 μl, 上游1 μl,下游1 μl, Taq DNA聚合酶, 0.25 μl, 灭菌注射用水29.75 μl, DNA 5 μl ；PCR循环参数：95℃预变性5 min, 95℃变性30 s, 60℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 循环35次, 最后72℃延伸10 min。用2%琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物。

1.2.3 PCR扩增产物直接测序 PCR产物用凝胶电泳DNA回收试剂盒纯化回收DNA片段后, 送北京奥莱博生物技术有限责任公司, 完成PCR扩增产物测序。

1.3 统计学方法 应用SPSS13.0软件进行分析。CD36内含子3 ［TG］重复序列多态性各组间分布情况比较采用χ2检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 正常对照组与T2DM组CD36内含子3 ［TG］重复序列基因多态性分布的比较 PCR反应扩增产物测序结果发现CD36内含子3 ［TG］重复序列有5种单体型, 即［TG］重复次数为11、12、13、15、16次, 全部为杂合子, 未发现纯合子(见图1)。

图1 PCR扩增产物直接测序结果

2.2 蒙古族与汉族2型糖尿病患者CD36内含子3 ［TG］重复序列单体型的分布比较 总体人群正常组与2型糖尿病患者之间CD36内含子3 ［TG］重复序列各种单体型分布差异无统计学意义(P>0.05)。朝鲜族与汉族之间CD36内含子3［TG］重复序列各种单体型分布差异无统计学意义(P>0.05)。但是CD36内含子3 ［TG］重复序列13次的单体型在蒙古族人群中正常组与2型糖尿病患者之间分布差异有统计学意义(χ2=9.368, P<0.05), 见表1。

表1 蒙古族与汉族人群中正常组与2型糖尿病患者CD36内含子3 ［TG］重复序列单体型分布比较［n(%)］

2.3 蒙古族与汉族2型糖尿病患者CD36内含子3 ［TG］重复序列基因型的分布比较 总体人群正常组与2型糖尿病患者之间CD36内含子3 ［TG］重复序列各种基因型分布差异无统计学意义(P>0.05)。蒙古族与汉族之间CD36内含子3［TG］重复序列各种基因型分布差异无统计学意义(P>0.05)。但是CD36内含子3 ［TG］重复序列13/n的基因型在蒙古族人群中正常组与2型糖尿病患者之间分布比较, P=0.062, χ2=3.471, 见表2。

表2 蒙古族与汉族人群中正常组与2型糖尿病患者CD36内含子3 ［TG］重复序列基因型分布比较［n(%)］

3 讨论

CD36是B类清道夫受体, 具有多种生物学功能, 参与包括炎症、止血、免疫清除、脂质代谢和动脉硬化在内的许多生理和病理过程［2,3］。国内外研究已证明CD36与动脉硬化的形成有关。Susztak等［4］在研究糖尿病肾病的发病机制中发现CD36的表达伴随近端小管上皮细胞凋亡以及小管上皮细胞变性, 高糖环境刺激近端小管上皮细胞可表达CD36。Sampson等［5］研究发现2型糖尿病患者发现2型糖尿病单核细胞上CD36表达上调, 认为2型糖尿病的发生与CD36表达增强有一定关系。郑寿焕等［6,7］研究认为, 糖尿病患者血清中sCD36水平明显升高, 且sCD36水平与血糖波动有关, CD36内含子3［TG］重复序列基因多态性与T2DM患者的发生有关。Griffin等［8］证实了葡萄糖可以通过增强CD36 mRNA的翻译过程上调其蛋白质的表达, 从而进一步上调CD36的表达。体外实验也已经证明［9］, 高血糖环境可上调CD36表达。Aase Handberg［10］等也用ELISA的方法检测2型糖尿病患者血浆中sCD36的含量, 发现2型糖尿病患者血浆中sCD36是正常组的4.5倍, 并与胰岛素抵抗有关。

本研究发现总体人群正常组与2型糖尿病患者之间CD36内含子3 ［TG］重复序列各种单体型及基因型分布差异无统计学意义(P>0.05)。蒙古族与汉族之间CD36内含子3 ［TG］重复序列各种单体型及基因型分布差异无统计学意义(P>0.05)。但是CD36内含子3 ［TG］重复序列13次的单体型在蒙古族人群中正常组与2型糖尿病患者之间分布差异有统计学意义(P<0.05)。并且CD36内含子3 ［TG］重复序列13/n的基因型在蒙古族人群中正常组与2型糖尿病患者之间分布比较, P=0.062, χ2=3.471。根据研究结果考虑CD36内含子3 ［TG］重复序列13次的单体型是蒙古族发生2型糖尿病的危险基因。

综上所述, 本研究认为CD36内含子3 ［TG］重复序列13次的单体型是蒙古族发生2型糖尿病的危险基因, 而CD36内含子3 ［TG］重复次数对CD36的表达及对2型糖尿病的发生和发展中的影响机制尚不明确, 需进一步研究。

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Correlation between CD36 haplotype gene and type 2 diabetes in Jilin Songyuan region

YAO Qingchun, YANG Xiu-li, ZHEN Shou-huan, et al.Department of Endocrinology, General Hospital of Jilin Oilfield, Songyuan 138000, China

T2DM; CD36; Genetic haplotype

138000 吉林油田总医院内分泌科(姚庆春 杨秀丽)；吉林省延边大学附属医院内分泌科(郑寿焕)；辽宁丹东第一医院(李金姬)

杨秀丽 E-mail：yangxiuli0916@163.com

【Abtract】 Objective To investigate the distribution of CD36 intron 3 ［TG］ repeat polymorphism in type 2 diabetes mellitus (T2DM) patients and to expore the correlation between the genetic polymorphism and type 2 diabetes mellitus (T2DM).Methods Genotypes of CD36 were typed in 193 T2DM patients and 40 normal person by polymerase chain reaction(PCR) and PCR-direct sequencing.Results ①Research Results found CD36 intron 3 (TG) there were five kinds of haplotype repeat sequences, namely ［TG］ repetitions for 11, 12, 13, 15, 16.②The distribution of CD36 intron 3 ［TG］ repeat genotype or haplotype has no significant difference between normal control group and T2DM group (P>0.05).③The distribution of CD36 intron 3 ［TG］ repeat genotype or haplotype has no significant difference between the Moggol nationality and the Han nationality (P>0.05).④The distribution of CD36 intron 3 ［TG］ repeat for 13 times exist statistically significant difference in the Moggol nationality between normal control group and T2DM group (P<0.05).Conclusion The distribution of CD36 intron 3 ［TG］ repeat for 13 times haplotype is a risk genes of type 2 diabetes in the Moggol nationality of songyuan region.