脊髓孤啡肽在大鼠炎症痛及针刺镇痛中的作用及其机制研究

杨宇 张宇平 董航 吴宇 王贺

·实验研究·

脊髓孤啡肽在大鼠炎症痛及针刺镇痛中的作用及其机制研究

杨宇 张宇平 董航 吴宇 王贺

目的 研究脊髓孤啡肽在大鼠炎症痛及针刺镇痛中的作用及作用机制。方法 16只大鼠作为研究对象, 利用完全弗氏佐剂构建大鼠慢性炎症痛模型, 对其行电针操作, 并于鞘内注射适量的脊髓孤啡肽及其受体拮抗剂, 观察脊髓孤啡肽在针刺操作中对大鼠炎症痛及针刺镇痛效果。结果 注射15 nmol脊髓孤啡肽的D组大鼠缩爪潜伏期水平明显高于注射生理盐水A组, 差异有统计学意义(P<0.05)；而注射15 nmol的B组与注射5 nmol的C组与A组比较, 差异无统计学意义(P>0.05)。相比单纯针刺治疗组、单纯脊髓孤啡肽组, 脊髓孤啡肽+针刺组大鼠缩爪潜伏期水平明显更高, 差异有统计学意义(P＜0.05)。结论 脊髓孤啡肽主要是通过抑制脊髓胶质细胞产生炎症因子, 参与痛觉调制达到镇痛的作用。

炎症痛；针刺镇痛；孤啡肽；作用；机制

炎症痛在临床上比较常见, 其发病机制尚不明确, 但细菌感染、病毒感染、创伤及外科手术等诸多因素可能引发外周组织损伤, 进而出现持续疼痛症状, 主要表现为痛觉过敏、自发疼痛等［1］。孤啡肽属于阿片受体的内源性配体, 相关研究表明孤啡肽及其受体在中枢神经系统中广泛存在, 参与痛觉调节等系列生理活动［2］。动物实验表明脊髓孤啡肽可以对神经痛大鼠发挥镇痛作用。本研究就此主要研究脊髓孤啡肽在大鼠炎症痛及针刺镇痛中的作用及作用机制, 现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择16只大鼠作为研究对象, 其中雄性大鼠12只, 体重85~287 g, 平均体重(186.7±20.9)g, 雌性大鼠4只, 体重56~250 g, 平均体重(136.8±18.7)g。16只大鼠饲养在12 h光照、12 h黑暗的环境中, 严格按照国际实验动物使用标准操作。主要药物及试剂：核糖核酸酶抑制剂、琼脂糖、逆转录酶M-MuLV、IL-1βmRNA、IL-6 mRNA、胰蛋白酶等。仪器设备：超声破碎机、细胞培养箱、显微镜、离心机、恒冷切片机、电针仪、辐射热测痛仪、电热干烤箱、过滤器等。1.2 方法

1.2.1 构建大鼠炎症痛模型 用戊巴比妥钠(计量为40 mg/kg)麻醉大鼠后, 把100 μl完全弗氏佐剂注射到大鼠左后肢, 构建慢性炎症痛模型。用辐射热测痛仪测定大鼠缩爪潜伏期情况, 具体操作：保持室温在18~22℃, 随后把大鼠放置到辐射热测痛仪玻璃中, 不限制大鼠活动。在大鼠静置20 min后开始测定, 每隔10 min测量1次, 测量3次后取均值。在这个过程中, 把缩爪潜伏期上限值设置为20 s, 保护大鼠不被烫伤。

1.2.2 电针操作 保持室温18~22℃, 于木架上固定大鼠躯干, 不限制大鼠头部、四肢的活动范围, 静置20 min后开始针刺治疗, 穿刺穴位为大鼠的环跳穴、阳陵泉穴, 合理设置电针治疗仪相关参数, 疏波频率为4 Hz, 串长2.5 s, 密波频率为60 Hz, 串长5 s。治疗以大鼠后肢肌肉轻度抖动为主, 治疗时间为0.5 h左右。另外进行“假电针”操作, 操作步骤与电针治疗一致, 唯一不同的是假电针不通电。

1.2.3 鞘内注射 麻醉大鼠后从上棘L3~4腰椎间隙处把PE-10聚乙烯管插入, 进管深度为3.5 cm, 溢出脑脊液后封锁外口, 缝合皮肤后将导管固定在皮肤上。同时每天注射10万U的青霉素G钾, 避免感染。不同的大鼠注射不同浓度的脊髓孤啡肽, 用10 μl的生理盐水进行稀释, 经由插入的PE-10聚乙烯管把脊髓孤啡肽注入脊髓蛛网膜下腔中, 注射时间为1 min, 严格控制注射速度。

1.2.4 相关物质检测 按照组织切片相关要求及标准完成大鼠组织切片制作, 然后利用免疫组织化学法检测切片中的染色信号等指标。抽取大鼠血液标本, 常规离心出血清, 提取出组织总蛋白, 并用Bradford方法测量蛋白质含量。

1.3 统计学方法 应用SPSS18.0统计学软件对上述各项数据进行整理。计量资料以均数±标准差( x-±s)表示, 采用t检验；计数资料采用χ2检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 脊髓孤啡肽对大鼠炎症痛的影响 大鼠炎症痛建模后把大鼠分为四组, 各4只, A组注射生理盐水, B组注射1.5 nmol脊髓孤啡肽, C组为5 nmol脊髓孤啡肽, D组为15 nmol脊髓孤啡肽, 给药前1.5 h、1 h、0.5 h、10 min观察大鼠缩爪潜伏期变化, D组大鼠缩爪潜伏期水平明显高于A组,差异有统计学意义(P＜0.05)。而B组、C组与A组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见图1。

图1 不同剂量脊髓孤啡肽不同时间段缩爪潜伏期变化情况

2.2 脊髓孤啡肽对大鼠针刺镇痛的影响 大鼠炎症痛建模后把大鼠分为四组, 各4只, A组注射生理盐水, B组采取电针治疗, C组为脊髓孤啡肽(15 nmol), D组为脊髓孤啡肽(15 nmol)+电针治疗, 给药前1.5 h、1 h、0.5 h、10 min观察大鼠缩爪潜伏期变化, 与A组比较, B组、C组及D组大鼠缩爪潜伏期水平明显增多, 其中D组大鼠缩爪潜伏期水平明显高于B组、C组, 差异有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨论

目前临床上治疗慢性炎症痛的方法很多, 如抗炎药物、镇痛药物等, 长时间服用会产生一定的毒副作用。针刺属于中医疗法, 安全有效, 可用于慢性炎症痛镇痛治疗。相关动物模型试验表明脊髓孤啡肽参与痛觉调制, 且不同水平的脊髓孤啡肽的镇痛作用不一。很多不同动物模型实验表明脊髓孤啡肽具有较高的镇痛作用, 且从鞘内注射脊髓孤啡肽能明显增强阿片肽的镇痛功效［3］。

3.1 脊髓孤啡肽在大鼠炎症痛及针刺镇痛中的作用 解剖学研究发现脊髓孤啡肽及其受体在中枢神经系统中广泛分布, 特别是和痛觉关系甚密的区域, 如脊髓背角等, 这表明内源性的脊髓孤啡肽-阿片受体样受体系统可能参与痛觉调制。本研究发现正常大鼠脊髓背角中也存在脊髓孤啡肽及其受体。另外在慢性炎症痛病程发展过程中脊髓背角的脊髓前孤啡肽原信使RNA表达不断上升, 而孤啡肽免疫阳性细胞含量却下降, 这与炎症痛发展过程中孤啡肽释放量大于其合成速度有关。同时阿片受体样受体信使RNA表达随之上升,表明脊髓孤啡肽-阿片受体样受体系统在炎症痛发展过程中被激活, 且参与到炎症痛调制中。

3.2 脊髓孤啡肽在大鼠炎症痛及针刺镇痛中的作用机制分析 疼痛、知觉等都是由神经元介导的, 特别是中枢神经系统, 该系统中含有的胶质细胞能为射精元提供营养支持, 且胶质细胞没有划分树突、突起无轴突, 进而没有其他细胞拥有的信号传递功能, 当痛觉导入信号时仅会让脊髓神经元的兴奋性产生变化, 可见脊髓层面上的疼痛调节与脊髓胶质细胞没有关系, 而与脊髓神经元及其递质密切相关。近年来相关研究发现脊髓神经元功能受脊髓胶质细胞影响, 在一定程度上参与到痛觉过敏及持续疼痛中。而脊髓胶质细胞与炎症、外周组织损伤等相关因素有关, 一旦脊髓胶质细胞被激活,则会释放很多与痛觉相关的致痛物质, 如白细胞介素-1β、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α等。这些炎症因子虽然与生理性痛无关, 但在病理性痛中有着不可或缺的作用。

［1］ 葛志军.脊髓水平NMDA受体NR1亚单位磷酸化在孤啡肽痛觉调控中的作用研究.中国医科大学, 2009.

［2］ 王薇钧, 卢峻, 黄怡然, 等.电针对慢性炎症疼痛大鼠下丘脑ENK与脊髓OFQ含量的影响.北京中医药大学学报, 2010(3): 196-199.

［3］ 崔晓鲁.侧脑室注射抗生长抑素血清在炎症痛及针刺镇痛中的作用机制.山东中医药大学, 2011.

2014-06-26］

110034 沈阳医学院生理学教研室(杨宇)；沈阳医学院临床医学系(张宇平 董航 吴宇 王贺)