平阳霉素新辅助化疗对阴茎癌组织c—myc、Ras—P21、P53蛋白表达影响的研究

徐磊 刘文龙 王志超 乔忠杰

[摘要] 目的 探讨应用平阳霉素新辅助化疗对阴茎癌组织基因蛋白c-myc、Ras-P21、P53表达的影响及意义。 方法 收集哈尔滨医科大学附属肿瘤医院泌尿外科1995～2005年罹患阴茎鳞状细胞癌的住院患者100例，按照术前是否进行辅助化疗分为两组，其中新辅助化疗组50例，术前应用平阳霉素化疗7 d，化疗后行阴茎部分切除术，并行双侧腹股沟淋巴结改良清扫术；对照组50例，直接行手术治疗（手术治疗方法同新辅助化疗组），术前不进行化学药物治疗。应用免疫组织化学法（SP）对两组患者的阴茎鳞状细胞癌组织进行c-myc、Ras-P21以及P53等指标检测。 结果 新辅助化疗组组织标本中c-myc、Ras-P21、P53等指标表达的阳性率经检测分别为30%、27%、23%。对照组组织标本中，c-myc、Ras-P21、P53等指标表达的阳性率经检测分别为52%、48%、50%。新辅助化疗组与对照组的c-myc、Ras-P21、P53指标表达阳性率比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 应用平阳霉素新辅助化疗后，阴茎鳞状细胞癌组织中c-myc、Ras-P21、P53蛋白的表达明显下降，平阳霉素新辅助化疗可降低阴茎癌的恶性程度。

[关键词] 阴茎癌；平阳霉素；新辅助化疗；免疫组织化学法

[中图分类号] R737.27 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）07（c）-0004-04

阴茎鳞状细胞癌是阴茎最常见的恶性肿瘤，传统的治疗方法多采用阴茎部分或全部切除配合腹股沟淋巴结清扫术[1]。临床采用平阳霉素新辅助化疗配合改良的淋巴结清扫术治疗阴茎癌取得了良好的效果。平阳霉素是由我国自主研制的抗肿瘤药物，从放线菌（Streptomycespingyangensisn.sp）培养液中分离得到，目前已成为我国临床常用的抗癌药物，被广泛应用于治疗头颈部等部位鳞癌、皮肤癌、食道癌、外阴癌、恶性淋巴瘤、乳腺癌和宫颈癌等恶性肿瘤。近年来，平阳霉素在临床应用过程中有不少新的发现与扩展。本研究应用免疫组织化学法研究平阳霉素新辅助化疗后阴茎癌患者肿瘤组织中c-myc、Ras-P21、P53蛋白表达的变化，以证实平阳霉素新辅助化疗治疗阴茎癌的效果。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择哈尔滨医科大学附属肿瘤医院（以下简称“我院”）1995～2005年罹患阴茎鳞状细胞癌患者100例，所有病例均附有完整的临床资料。年龄35～86岁，平均（42.2±0.03）岁；病程5个月～3年，平均（1.6±0.02）年。其中包茎83例，包皮过长17例；临床表现为阴茎头部、冠状沟、包皮内板处丘疹、溃疡、菜花状肿物，脓性分泌物80例，恶臭76例，3例尿道狭窄，有排尿困难；术前、术后病理检测均为阴茎鳞状细胞癌，83%以上的患者有腹股沟淋巴结转移。按照术前是否进行辅助化疗分为新辅助化疗组和对照组，每组各50例。两组患者一般资料比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法 新辅助化疗组50例，术前于阴茎头肿瘤处取病理组织证实为鳞状细胞癌。常规血液检验如血常规、肝肾功能等，并行胸部正侧位X线片检查，结果正常后进行化疗。化疗方案如下：平阳霉素8 mg+生理盐水2 mL深部肌内注射，每天1次。同时可给予对症支持治疗，给药时间为7 d，2周后经各项检查正常后行阴茎部分切除术加改良腹股沟淋巴结清扫术。

对照组50例，术前于阴茎头肿瘤处取病理组织证实为鳞状细胞癌。术前未行任何治疗，行阴茎部分切除术+改良的腹股沟淋巴结清扫术。

1.2.2 病理检查方法 本研究的所有标本均来自我院病理科，附有查找完整的临床资料。两组患者术后病理均取材于阴茎头肿瘤组织，检测均为阴茎鳞状细胞癌，标本经10%福尔马林固定、石蜡包埋。每个标本均制成5 μm厚的组织切片3张，3张切片均行c-myc、Ras-P21、P53免疫组化染色。

采用免疫组织化学SP法：石蜡切片脱蜡和水化后，冲洗3次；将过氧化酶阻断剂加入；PBS（pH=7.4）冲洗3次；抗原微波修复，pH6.0枸橼酸缓冲液共计15 min冲洗，冲洗后自然冷却，时间共20 min，再次使用PBS清洗标本3次，各1 min；将10%即用型非免疫血清加入每张切片，于37℃下孵育10 min；加入第一抗体（鼠抗人c-myc、ras-P21及P53）4℃过夜；标本加1滴或50 μL的二抗，加入二抗后于37℃下湿盒孵育30 min；使用PBS清洗标本3次，每次1 min；标本加链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶，37℃下孵育30 min；使用PBS清洗标本冲洗3次，每次5 min；蒸馏水冲洗2次，1 min，苏木素复染30 s～1 min，脱水后树胶封片。以上试剂均来自北京生物技术有限公司。

对照染色使用TBS缓冲液代替单抗，细胞膜和细胞质可见棕黄色颗粒样着色为Ras-P21蛋白阳性标记；细胞质和细胞核可见棕黄色颗粒样着色为c-myc蛋白阳性标志。P53蛋白细胞核内有棕黄色颗粒着色为阳性标志。

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 15.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

两组患者术后免疫组织化学SP法结果显示：对照组50例标本中表达阳性者，c-myc为26例，占52%；Ras-P21为4例，占48%；P53为23例，占46%。新辅助化疗组的50例标本中表达阳性者，c-myc为15例，占30%；Ras-P21为13例，占26%；P53为11例，占22%。新辅助化疗组与对照组比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图1～6，表1～3。

3 讨论

阴茎鳞状细胞癌是阴茎最常见的恶性肿瘤，针对阴茎鳞状细胞癌的传统治疗方法多以手术为主，术式多采用阴茎全切除术、阴茎部分切除术等，因阴茎鳞状细胞癌患者多伴有腹股沟淋巴结肿大，其中约50%经病理证实为淋巴结转移，阴茎癌手术同时行双侧腹股沟淋巴结清扫术，患者创伤大，常因阴茎切除范围较大而出现影响术后性生活甚至丧失，排尿姿势改变等并发症，因腹股沟淋巴结清扫术后出现严重的双下肢及阴囊水肿等并发症，明显降低了患者的生活质量。我院采用平阳霉素新辅助化疗配合改良的手术治疗阴茎癌，明显地提高了阴茎癌患者生存率，降低了复发率，增加了最大保留阴茎功能的机会，提高了患者的生活质量[2]。

近年来，Ras-P21基因在恶性肿瘤的发病中受到了一定的重视视，并被视为一种预后基因，如肺癌、肠癌[3]、膀胱癌[4]等，不但ras基因异常活化，而且P21有不同程度的表达[5]；恶性程度越高，Ras-P21表达越高，预后越差[6-10]。有学者证实Ras-P21蛋白对阴茎癌的预后、恶性度的评估有重要的参考意义[11]。

C-myc基因是myc基因家族的重要成员之一，是一种可易位基因、可调节基因，其表达的变化与细胞的增殖及分化状态有关，其表达产物也参与了多种肿瘤的发生发展。有学者指出，浸润程度增高的胃癌患者的肿瘤组织标本中，c-myc基因产物P62的表达增强[12]，而且c-myc表达产物P62阳性者较阴性者预后差，复发率高[13]。有学者发现c-myc表达增强的阴茎癌患者，临床期别更晚、恶性程度更高、预后更差，阴茎癌的复发、转移率以及肿瘤相关病死率都高于c-myc表达阴性者，提示c-myc蛋白表达可以协助评价阴茎癌病情进展及预后情况[14]。

P53是一种肿瘤抑制基因，对细胞生长、凋亡和DNA修复有重要的调控作用，在近50%的恶性肿瘤中会出现P53基因的突变。野生型P53基因和突变型P53基因均参与细胞凋亡的调节，野生型P53对细胞凋亡有促进作用，而突变型P53则对细胞凋亡有抑制作用。而P53基因的过度表达往往源于P53基因的突变。P53突变是阴茎癌发生的早期事件[15]。研究表明P53蛋白参与了阴茎癌的发病过程[16]。

以上的研究结果表明，Ras-P21、P53以及c-myc蛋白的表达可以作为判断阴茎癌恶性程度的良好指标。c-myc、Ras-P21、P53的阳性表达与肿瘤的组织分级、临床分期、预后有关，分化程度越差，临床分期越晚，阳性表达率越高，患者预后越差。

在本研究中，应用此3个蛋白的表达程度作为判断平阳霉素新辅助化疗效果的指标，采用免疫组织化学法对应用平阳霉素新辅助化疗（新辅助化疗组）和未应用平阳霉素化疗（对照组）的阴茎癌患者石蜡包埋病理组织各50例标本进行了检测。在对照组50例患者中，Ras-P21蛋白阳性24例（48%），而新辅助化疗组P21蛋白阳性13例（26%）；对照组c-myc蛋白阳性26例（52%），而平阳霉素新辅助化疗组c-myc蛋白阳性15例（30%）；对照组P53蛋白阳性23例（46%），新辅助化疗组P53蛋白阳性11例（22%），两组差异有统计学意义（P < 0.05），见表1～3。新辅助化疗后c-myc、P21、P53蛋白表达水平均显著降低，提示平阳霉素新辅助化疗可明显降低阴茎癌的恶性程度。

综上所述，应用平阳霉素新辅助化疗明显降低了Ras-P21、P53及c-myc蛋白表达的阳性率，降低了阴茎癌的恶性程度。本研究为平阳霉素新辅助化疗配合手术治疗阴茎癌，最大程度地保留阴茎功能，降低阴茎癌的复发率，提高患者的生存质量及生存率提供分子生物学理论依据。平阳霉素新辅助化疗治疗阴茎癌值得临床上推广应用。

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（收稿日期：2014-04-14 本文编辑：苏 畅）