人结直肠黏膜层淋巴管微细分布及超微结构

赵斌 陈福军 于海涛 付岩 王锡山

结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一，淋巴道转移是其广泛播散的主要途径。近年来，随着癌细胞淋巴道转移机理研究的不断深入，人体各部位器官内淋巴管的分布规律和形态特征的研究已见一些文献报道。本文应用半薄切片、光镜观察及超薄切片电镜观察的方法研究了人结直肠黏膜层内淋巴管的微细分布和超微结构，以期为进一步探讨结直肠癌淋巴道转移机制提供必要的基础材料。

材料与方法

一、一般资料

哈尔滨医科大学附属肿瘤医院结直肠外科住院手术患者40例，均为单发、无远处转移肿瘤。结肠标本取材部位距肿瘤大于10 cm，直肠标本为距肿瘤下缘大于3 cm。全层取材。标本以中性福尔马林及戊二醛固定。共40个蜡块。

鼠抗人D2-40单克隆抗体、鼠抗CD34单克隆抗体、PV-6002二步法免疫组化检测试剂盒、ZLI-9032浓缩型DAB试剂盒均购自中杉金桥生物技术有限公司。

二、方法

中性福尔马林固定标本经病理科脱水-透明-浸腊-包埋常规处理。共40个蜡块标本，每块以10 um厚切片，连续切片切3张，一张经HE染色，另二张采用免疫组化EnVision二步法染色。切片分别标记D2-40及CD34，D2-40阳性而同部位CD34阴性者为淋巴管阳性。戊二醛固定标本经超薄切片，J EM2120 透射电镜观察。HE染色用来排除肿瘤侵润。

常规脱蜡、水化组织切片。组织切片抗原修复——微波加热。3%H2O2孵育10 min，PBS冲洗，2 min3次。加一抗，4度冰箱过夜。PBS冲洗2 min 3次，加PV-6002室温孵育30 min，PBS冲洗2 min 3次。DAB显色10 min，自来水冲洗，封片。

结 果

一、光镜观察结果

CD34与D2-40染色无交叉。图1和图2为CD34染色未见棕黄色，图3和图4为D2-40染色，于相同部位见棕黄淋巴管染色。

在光镜下，结直肠壁分4层：即黏膜层、黏膜下层、肌层和浆膜层，各层均含有淋巴管，黏膜层淋巴管，多位于黏膜固有层的深层。在黏膜肌内也可见到毛细淋巴管，并向下深入至黏膜下层，可能是黏膜层毛细淋巴管与黏膜下层毛细淋巴管之间的吻合管(图5)。固有层内孤立淋巴小结周围可见淋巴管(图6)。黏膜层淋巴管管壁较薄，多为单层内皮组成，形状不规则，可呈现为扩张、圆形、椭圆形、多角形或闭锁的条索状，有时管壁不完整。

图1 J EM2120透射电镜下CD34免疫组织化学染色图像(10×10);图2 J EM2120透射电镜下CD34免疫组织化学染色图像(10×40);图3 J EM2120透射电镜下D2-40免疫组织化学染色图像(10×10);图4 J EM2120透射电镜下D2-40免疫组织化学染色图像(10×40)

图5 光镜下结肠壁组织图像，可见黏膜层毛细淋巴管与黏膜下层毛细淋巴管之间的吻合管(10x10);图6 光镜下结肠壁组织图像，可见固有层内淋巴管(10x10)

二、电子显微镜观察结果

我们也发现黏膜层可见毛细淋巴管，位于黏膜固有层与黏膜肌层之间，官腔狭窄，仅由一层内皮细胞构成，无孔窗，无周细胞，基膜不连续，可见镶嵌连接，胞质细胞器少。

三、CD34染色广泛存在于黏膜固有层及黏膜肌层，管腔小，管壁薄，数量多。

讨 论

迄今为止，有关淋巴管形成与肿瘤转移及预后的研究才刚刚起步，主要原因是缺乏淋巴管特异标记物。常规组织学切片HE染色无法确切区分淋巴管及血管，近年来，随着一系列淋巴管标记物的相继出现，使肿瘤淋巴管生成与肿瘤转移及预后关系的研究逐渐成为继肿瘤血管之后的新研究热点[1]。

D2-40是肾小球足突细胞膜表面的跨膜粘蛋白，分子量为40 kDa，参与足细胞足突的形成和塑形。Geleff等[2]于1999年首次报道在淋巴系统中D2-40似乎仅在被覆单层内皮细胞的小淋巴管，如终末淋巴管显色，这些小淋巴管同时也表达VEGFR-3。它既不能使细胞或平滑肌的大淋巴管显色，也不能使淋巴结内的高内皮静脉显色。超微结构研究也表明D2-40主要表达于淋巴管内皮细胞的腔面，少部分表达于非腔面和细胞间质。而在大淋巴管及血管内皮中均不表达。其特异性明显高于目前常用的淋巴管标记物VEGFR-3、VEGF-C等。本研究发现D2-40标记的淋巴管染色清晰，提示D2-40是研究肿瘤微淋巴管特异性相对较高的标记物。

通过淋巴管和血管转移是胃肠道恶性肿瘤转移的重要途径，恶性肿瘤细胞通过淋巴管和血管可以转移到原发肿瘤以外的器官，大量临床研究表明LVD与胃癌和结直肠癌的预后显著相关[3，4];除此之外，恶性肿瘤细胞还借助血管提供其生长所需的营养物质，并借助血管和淋巴管的引流维持组织的渗透压[5]。因此，研究淋巴管和血管分布和生成特点有助于我们加深了解肿瘤的发生和发展机制。

当肿瘤细胞局限于黏膜内时，肿瘤细胞对氧气和养分的需求增加较小，正常的血管供应可以满足肿瘤细胞生长的需要。但肿瘤细胞的代谢较为旺盛，导致肿瘤组织的渗透压在该阶段增加较快。因此，需要更多的淋巴管引流组织液以维持组织渗透压。

长期以来，绝大多数学者认为正常大肠黏膜层内不存在微淋巴管，所以大肠腺瘤即使癌变，如未突破基底膜，也不会发生转移。故WHO2000年分类建议放弃使用“原位癌”的概念，而改用“高级别上皮内瘤变”。这样命名的主要目的是防治过度治疗。然而我们的研究发现，在正常大肠黏膜层内也有微淋巴管，且位于黏膜肌层两侧，在黏膜肌内，也可见到毛细淋巴管，并向下深入至黏膜下层，与黏膜下层毛细淋巴管之间吻合，这与部分报道结直肠固有层存在淋巴管[6]观点不符，与既往经典的组织学描述更不一致。WHO 2000年结直肠癌定义为肿瘤穿透黏膜肌层到达黏膜下层，没有对侵及黏膜肌层作描述，认为结直肠高级别上皮内瘤变不发生转移，然而，蔡宏等人的回顾性研究证实，结直肠癌浸润至黏膜肌层时有发生转移的可能[7].这是否与黏膜层存在淋巴管有关。He等[8]研究了从骨髓获得的内皮祖细胞及既存的淋巴管内皮细胞，在肿瘤淋巴管新生中不同的促进贡献度。在肿瘤或VEGF-C诱导的新生淋巴管模型中，没有发现作了遗传标记的骨髓内皮祖细胞有明显的作用。在肿瘤周边区域，淋巴管新生的程度与淋巴管密度有相关性，不过虽然存在淋巴管新生，在淋巴管网发育不全的VEGF-C(+/-)小鼠却没有发生肿瘤淋巴管转移。研究显示：在肿瘤淋巴管新生和肿瘤细胞经淋巴管转移的过程中，新形成的淋巴管是从既存的淋巴管网通过发芽方式产生的，而来源于骨髓的内皮祖细胞在其中只起很小或不起作用。Achen等[9]的研究结果显示，肿瘤在缺氧情况下分泌VEGF-C，通过旁分泌方式到达局部淋巴管，与VEGFR-3结合，促进淋巴管内皮细胞以出芽方式向肿瘤组织生长，新生淋巴管可到达肿瘤周围甚至进入瘤内，增加肿瘤转移的机会。因此，黏膜层存在淋巴管可作为早期转移的解剖学依据。

早期肿瘤转移的因素很多，正常大肠黏膜层内存在微淋巴管这一发现的生物学意义仍有待于进一步观察。

[1] Krishnan J，Kirkin V，Steffen A，et al.Differential in vivo and vitroexpression of vascular endothelial growth factor(VEGF)-C and VEGF-D in tumors and its relationship to lymphatic metastasis in immunocompetent rats.Cancer Res，2003，63：713-722.

[2] Karpanen T，Egeblad M，Karkkainen MJ，et al.Vascular endothelial growth factor C promotes tumor lymphangiogenesis and intralymphatic tumor growth.Cancer Res，2001，61：1786-1790.

[3] Liang P，Hong JW，Ubukata H，et al.Increased density and diameter of lymphatic microvessels correlate with lymph node metastasis in early stage invasive colorectal carcinoma.Virchows Arch，2006，448：570-575.

[4] Matsumoto K，Nakayama Y，Inoue Y，et al.Lymphatic microvessel density is an independent prognostic factor in colorectal cancer.Dis Colon Rectum，2007，50：30-31.

[5] Schoppmann SF.Lymphangiogenesis，inflammation and metastasis.Auticancer Res，2005，25：4503-4511.

[6] World Health Organization classification of tumor.Pathoiogy and genetics of tumours of the digestivesystem.IARC，2000：105-118.

[7] 蔡宏，莫善兢，师英强，等.早期结直肠癌淋巴结转移的基础和临床研究.中国实用外科杂志，2005，25(5)：273-276.

[8] He Y，Rajantie I，Ilmonen M，et al.Preexisting lymphatic endothelium but not endothelial progenitor cells are essential for tumor lymphangiogenesis and lymphatic metastasis.Cancer Res，2004，64(11)：3737-3740.

[9] Achen MG，McColl BK，Stacker SA.Focus on lymphangiogenesis in tumor metastasis.Cancer Cell，2005，7(2)：121-127.