胎盘儿茶酚氧位甲基转移酶rs4818、rs4633位点基因多态性与子痫前期的关系

赖宝玲，王晨虹，周璐，王勤，苏卫兰

(南方医科大学附属深圳市妇幼保健院 产科，广东 深圳 518028)

胎盘儿茶酚氧位甲基转移酶rs4818、rs4633位点基因多态性与子痫前期的关系

赖宝玲，王晨虹，周璐，王勤，苏卫兰

(南方医科大学附属深圳市妇幼保健院 产科，广东 深圳 518028)

目的探讨胎盘儿茶酚氧位甲基转移酶(catechol-o-methyltransferase，COMT)基因rs4818、rs4633位点单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)与子痫前期发病的关系。方法便利抽样法选择2011年3月至2012年8月在南方医科大学附属深圳妇幼保健院产科住院分娩的孕妇217例，其中子痫前期孕妇92例为子痫前期组，健康孕妇125例为对照组。收集两组孕妇产后胎盘组织，提取胎盘DNA，应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix- assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometer，MALDI-TOF-MS)平台及MassARRAY-IPLEX技术对COMT基因 rs4818及rs4633位点进行检测,分析其基因型及等位基因分布情况。结果胎盘组织COMT基因rs4818位点基因型GG、GC、CC的基因型频率和G、C等位基因频率在子痫前期组与对照组之间的分布差异均无统计学意义(P>0.05)。两组胎盘COMT基因 rs4633位点CC、CT、TT三种基因型频率和C、T等位基因频率在子痫前期组与对照组之间的分布差异无统计学意义(P>0.05)。结论胎盘COMT rs4818、rs4633单核苷酸多态性与子痫前期发生无关。

子痫前期；儿茶酚氧位甲基转移酶；基因多态性;胎盘

[Nurs J Chin PLA,2014，31(9)：30-32,42]

子痫前期发病率较高，是引起围产期孕妇及新生儿发病的重要原因[1]。尽管研究多年，其病因和发病机制仍未明确。但胎盘被公认是子痫前期发病的关键因素。动物实验[2]发现，胎盘儿茶酚氧位甲基转移酶(catechol-o-methyltransferase，COMT)基因缺失的孕鼠出现子痫前期样临床及病理改变，如早产、血压升高、尿蛋白升高等；胎盘出现类似人类蜕膜血管病变，且出现肾小球血管内皮病变。由此提出胎盘COMT低表达可能是子痫前期发病的启动因素。前期研究[3-4]显示，患重度子痫前期的汉族产妇胎盘COMT表达明显低于对照组，而COMT是儿茶酚胺和雌激素代谢过程的重要酶。研究[5]表明，编码COMT的基因具有遗传多态性，而其常见的rs4818、rs4633位点基因多态性与基因表达、酶活性有关。因此，其编码基因的多态性可能与子痫前期发生有关。目前，有关胎盘COMT基因多态性与子痫前期发病关系的研究鲜见报道。因此，本实验拟通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(matrix- assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometer，MALDI-TOF-MS)检测胎盘组织COMT rs4818和rs4633两个位点基因多态性，进一步探讨与子痫前期相关的胎盘COMT低表达的上游原因。

1 对象与方法

1.1 研究对象 便利抽样法选取2011年3月至2012年8月在南方医科大学附属深圳妇幼保健院产科住院分娩的孕妇217例，其中子痫前期孕妇92例为子痫前期组，健康孕妇125例为对照组，收集两组孕妇产后胎盘组织。子痫前期诊断标准参照乐杰主编的《妇产科学》(第7版)，即孕20周后首次出现至少间隔6 h的2次血压≥140/90 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，且24 h尿蛋白定量≥300 mg。两组孕妇均为中国汉族妇女、单胎无畸形。两组孕妇年龄、产次分布均衡，且无慢性高血压、心脏病、肾病、糖尿病及肝病病史。所有孕妇产前均签署知情同意书，并报医院伦理委员会批准。

1.2 研究方法

1.2.1 标本采集 胎盘娩出10 min内，从胎盘母体面中央无菌剪取约0．5 cm×0．5 cm×0.5 cm的胎盘绒毛组织(避开出血、坏死及钙化区域)1块，用磷酸盐缓冲液(PBS，美国Hyclone公司)反复漂洗，干纱布吸除水分，装入无菌无RNA/DNA酶冻存管-80℃冰箱保存待测。

1.2.2 基因检测 应用MALDI-TOF-MS平台及MassARRAY-IPLEX技术检测COMT rs4818及rs4633位点基因型。TRIzol(Invitrogen公司)提取胎盘组织总DNA，用紫外分光光度计测定DNA纯度和浓度。引物设计：采用Sequenom公司AssayDesigner软件包设计扩增引物(见表1，引物设计合成均由深圳华大基因公司完成)。将DNA样本稀释到5 ng/μL，使用Ex Taq聚合酶，在384孔板常规扩增待测片段(PCR反应条件：94℃预变性15 s；94℃变性20 s、56℃退火30 s、72℃延伸1 min，进行45个循环；最后72℃延伸3 min)，然后在PCR产物中加入2 μL碱性磷酸酶(Shrimp alkaline phosphatase ，SAP)反应液，去除未反应完的dNTP(反应程序：37℃40 min、85℃5 min)，然后根据SEQUENOM程序进行单碱基延伸反应(single base extension，SBE)。所得反应产物加入6 mg树脂脱盐，混合后补充16 μL去离子水。用纳升点样仪将产物分点在质谱微阵列芯片上。

表1 COMT基因两个位点SNP检测的引物

2 结果

2.1 两组孕妇胎盘COMT基因 rs4818和rs4633位点的基因型的Hardy-Weinberg遗传平衡定律检测 子痫前期组和对照组胎盘COMT rs4818位点和rs4633位点的频率分布经拟合优度χ2检验，均P>0.05，符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律(子痫前期组rs4818位点：χ2=2.566 ,P=0.11;rs4633位点：χ2=2.464，P=0.12；对照组rs4818位点：χ2=3.277，P=0.07；rs4633位点：χ2=2.724，P=0.10)，表明本研究所选的样本代表性好。

2.2 两组胎盘COMT基因 rs4818位点基因型及等位基因频数分布 见表2。两组胎盘COMT基因 GG 、GC、和CC基因型频数分布差异无统计学意义(P>0.05)；G、C等位基因频数分布差异亦无统计学意义(P>0.05)。

表2 两组胎盘COMT基因 rs4818位点基因型频率及等位基因频率分布[n(%)]

2.3 两组胎盘COMT基因 rs4633位点基因型及等位基因频数分布 见表3。两组胎盘COMT基因 CC 、CT、 TT各基因型频数分布差异无统计学意义(P>0.05)；且等位基因C、T在病例组和对照组频数分布差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 两组胎盘COMT 基因rs4633位点基因型频率及等位基因频率分布[n(%)]

3 讨论

本研究应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术检测中国汉族产妇胎盘COMT基因 rs4818和rs4633位点基因多态性，分析其与子痫前期发生的关系。本病例对照研究未发现胎盘COMT rs4818和rs4633位点基因多态性与子痫前期的相关性。

COMT是广泛存在于人体内的一种代谢酶，是儿茶酚胺和雌激素代谢的关键酶。编码COMT基因位于22号染色体1区2亚带，包含6个外显子[5]。前期研究[3-4]发现，重度子痫前期组胎盘COMT mRNA及蛋白表达均明显低于对照组，但导致其低表达的上游机制不详。研究[5]发现，COMT活性主要由遗传因素决定，而COMT活性降低可导致儿茶酚雌激素代谢减慢，致使儿茶酚雌激素积聚，进而易发生多种疾病。较多资料[6-7]表明，COMT的基因多态性在不同种族和个体间的差异与精神疾病、慢性疼痛、乳腺癌、子宫内膜异位症、绝经时间等有关。因此，认为COMT基因突变可能导致酶活性下降、儿茶酚胺灭活减少，二-甲氧雌二醇(2-ME)合成减少，可能增加子痫前期的危险[8]。COMT具有多个功能性单核苷酸多态性，rs4680、rs4818、rs6269和rs4633是研究最广泛的位点。不同种族人群研究[9-11]发现，COMT基因多态性与子痫前期发病可能相关，然而对胎盘的相关研究缺乏。而胎盘是子痫前期发病的关键所在，因此研究胎盘COMT基因多态性更有助于揭示子痫前期病因。目前，检测胎盘COMT基因多态性与子痫前期关系的研究仅见一篇[12]，该研究检测72名正常产妇与13名子痫前期产妇胎盘COMT基因多态性，发现COMT rs4818位点基因多态性AA基因型明显增加子痫前期患病风险。本研究进行胎盘COMT两个位点基因多态性检测未发现两组基因rs4818、rs4633位点基因多态性具明显差异，说明COMT rs4818、rs4633位点基因多态性与子痫前期发生无相关性。然而子痫前期是一个多因素参与、多阶段发展的复杂病变，很可能是由多基因决定和受多种环境因素影响的疾病[13-15]。而且COMT的基因型频率及等位基因频率分布在不同种族、群体、个体间存在差异[16-17]，加之抽样本身存在的偏差和样本量的大小都会对研究结果产生影响，单个SNP改变对疾病的影响较小，下一步加大样本量进行多个SNP联合检测并进行单体型分析，有助于深入研究子痫前期病因与COMT的关系。

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(本文编辑：郁晓路)

AssociationbetweenPolymorphismsofPlacentalCatechol-o-methyltransferaseGeners4818、rs4633andPreeclampsia

Lai Baoling，Wang Chenhong，Zhou Lu，Wang Qin ，Su Weilan

Corresponding(Department of Obstetrics，Shenzhen Maternity and Child Healthcare Hospital affiliated to South Medical University，Shenzhen 518028, Guangdong Province,China)

Corresponding author: Wang Chenhong，E-mail: noralibrary@163.com

ObjectiveTo investigate whether polymorphisms of placental COMT gene are associated with preeclampsia，and to explore the role of COMT in the pathogenesis of preeclampsia.MethodsBy convenience sampling，217 patients were randomly selected including 92 patients with preeclampsia and 125 normal pregnant women.Placental tissue were collected and to extract DNA.Placental COMT (rs4818 and rs4633) polymorphisms were genotyped by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry(MALDI-TOF-MS) and MassARRAY-IPLEX.ResultsThere were no significant differences in placental COMT rs4818 GG，GC,CC genotypes frequencies and G，C allele frequencies and between patients with preeclampsia and control group (P>0.05).There were no significant difference between two groups of the placenta COMT rs4818locus CC，CT，TT in patients with preeclampsia and control group(P>0.05).ConclusionPlacental COMT rs4818 and rs4633 genotypes have no association with preeclampsia.

preeclampsia；catechol-o-methyltransferase (COMT)；gene polymorphism

2013-06-27

2014-02-10

深圳市科技创新委员会资助项目(180)

赖宝玲，博士，主要从事围生期医学研究

王晨虹，E-mail：noralibrary@163.com

10.3969/j.issn.1008-9993.2014.09.009

R473.71

A

1008-9993(2014)09-0030-04