缺氧缺血性脑病新生大鼠肾脏Bax和Caspase-3蛋白的表达与肾细胞凋亡的作用机制

刘钊 李易明 王冀 王蕾 李文建

·论著·

缺氧缺血性脑病新生大鼠肾脏Bax和Caspase-3蛋白的表达与肾细胞凋亡的作用机制

刘钊 李易明 王冀 王蕾 李文建

目的探讨缺氧缺血性脑病(HIE)新生大鼠肾脏Bax和Caspase-3蛋白的表达与肾细胞凋亡的作用机制。方法新生7 d Wistar大鼠制备HIE模型。分为假手术对照组和HIE组，于HIE后6、12、24和48 h处死大鼠，取肾脏组织，应用流式细胞术检测肾细胞凋亡情况；应用免疫组织化学法检测肾细胞Bax和Caspase-3蛋白的表达情况；ELISA法检测TNF-α、IL-1β的分泌；应用Western blot技术检测肾细胞凋亡与p38MAPK信号通路的关系。结果HIE组6 h肾脏阳性凋亡细胞开始增多，24 h达到高峰，各时间点阳性凋亡细胞均高于对照组(P<0.05)； HIE组12 h Bax和Caspase-3阳性细胞表达开始增多，24 h达到高峰，各时间点阳性细胞均高于对照组(P<0.05)；HIE组6 h TNF-α、IL-1β分泌开始增多，TNF-α12 h达到高峰，IL-1β 24 h达到高峰各时间点TNF-α、IL-1β均高于对照组(P<0.05)；HIE组6 hp-p38MAPK蛋白表达开始增多并达到高峰，各时间点p-p38MAPK蛋白均高于对照组(P<0.05)。结论HIE新生大鼠肾脏细胞Bax和Caspase-3蛋白表达增加，提示Bax和Caspase-3蛋白表达对肾脏细胞凋亡有促进作用，其可能通过p-p38MAPK信号通路实现的。

Bax；Caspase-3；凋亡；缺氧缺血性脑病；肾脏细胞；p-p38MAPK

缺氧缺血性脑病是围产期窒息导致脑组织缺氧缺血性损伤，是新生儿常见疾病，是新生儿死亡或运动、智力障碍的常见原因[1]。HIE除脑组织缺氧缺血性损伤外，全身多器官均有损伤，其中，肾脏为损伤的重要脏器之一。目前，人们对HIE造成的脑损伤研究报道较多[2，3],而对HIE发生后肾脏损伤研究较少，凋亡相关基因的表达对肾细胞凋亡的影响鲜有报道。本研究通过应用流式细胞术检测肾细胞凋亡情况；应用免疫组织化学法检测肾细胞Bax和Caspase-3蛋白的表达情况；ELISA法检测TNF-α、IL-1β的分泌；应用Western blot技术检测肾细胞凋亡与P38MAPK信号通路的关系，探讨HIE新生儿肾脏损伤的发生机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 Annexin V-FITC/PI试剂盒(美国BD公司)；鼠抗兔Bax和Caspase-3单抗、TNF-α、IL-1 βELISA试剂盒(美国 eBioscience公司)；蛋白酶抑制剂、去磷酸化酶抑制剂、p-P38和β-actin抗体(美国Sigma公司)；Western blot试剂和标准Marker(美国Bio-Rad公司)；流式细胞仪(美国BD公司)；酶标仪(美国Invitrogen公司)；蛋白电泳(美国Bio-Rad公司)。

1.2 实验动物及分组 将生长条件相同的新生7 d Wistar大鼠，雌雄不限，共40只，随机分为假手术对照组和HIE(6、12、24和48 h)组，每组8只。假手术对照组只予分离左侧颈总动脉，不结扎动脉，缝合皮肤；HIE组分离并结扎左侧颈总动脉，缝合皮肤，术后放回鼠笼恢复2 h。随后，置于密闭玻璃器皿中，以湿化的8%氧气和92%氮气的混合气体输入玻璃器皿中，持续3～4 h制成新生大鼠HIE动物模型[4]。

1.3 标本取材 HIE后6、12、24和48 h后处死大鼠，去除肾脏包膜，沿矢状正中线切开，将肾脏皮质分为4份，分别用于流式检测、免疫组织化学、ELISA和Western blot检测。

1.4 实验方法

1.4.1 Annexin V凋亡检测肾脏细胞凋亡情况：收集肾细胞，预冷PBS洗涤2次，悬浮细胞，调整细胞个数为1×106cells/ml，按照BD试剂盒说明书完成Annexin V-FITC/PI双染色后，PBS洗涤后，立刻上机检测。

1.4.2 免疫组化检测Bax和Caspase-3蛋白的表达：肾脏石蜡包埋组织切片经脱蜡、水化、抗原修复，加3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，加一抗(Bax和Caspase-3单抗)，室温孵育1 h，加试剂A-聚合物增强剂，室温孵育20 min，加试剂B-酶标抗鼠/兔聚合物，室温孵育30 min，再经DAB显色，苏木素衬染，脱水干燥，中性树脂封片。

1.4.3 TNF-α、IL-1β细胞因子的检测：将肾皮质用剪刀剪碎再用玻璃匀浆器充分匀浆，12 000 r/min，4℃，离心30 min后取上清，TNF-α、IL-1β浓度的检测采用ELISA法，具体操作根据试剂盒说明书进行。

1.4.4 Western blot检测P38MAPK信号通路情况：将肾脏用剪刀剪碎，按照蛋白抽提试剂盒说明加入试剂，再用玻璃匀浆器充分匀浆。12 000 r/min，4℃，离心30 min后取上清，取上清液后进行蛋白定量。制备的蛋白样品进行10%SDS-PAGE电泳分离，再以400 mA恒流电转印到PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h,再加入一抗4℃孵育过夜，次日TBS-T洗涤3次，10 min/次，加入辣根酶标记的二抗室温孵育1 h，再TBS-T洗涤3次，10 min/次，ECL化学发光剂发光检测信号。

2 结果

2.1 5组大鼠肾细胞凋亡的情况 结果显示对照组阳性凋亡细胞为2.75%，HIE组6 h肾脏阳性凋亡细胞开始增多，24 h达到高峰，各时间点阳性凋亡细胞仍高于对照组(P<0.05)。见图1。

图1 肾细胞凋亡活性的流式细胞术检测

2.2 5组大鼠肾脏组织Bax和Caspase-3免疫组化染色结果比较 应用免疫组化染色显示，HIE组Bax和Caspase-3表达量明显升高，可见大量的强阳性棕褐色颗粒，而对照组中Bax和Caspase-3的表达极低，几乎看不到棕褐色颗粒，差异明显(P<0.05)；在HIE后24 h Bax和Caspase-3表达达到高峰，明显高于其他时间点，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2、3。

图2 5组大鼠肾组织Bax蛋白表达图像(免疫组化×400)

图3 5组大鼠肾组织Caspase蛋白表达图像(免疫组化×400)

2.3 ELISA测定TNF-α、IL-1β分泌水平变化 采用ELISA技术检测5组肾细胞中的TNF-α、IL-1β的分泌。HIE组6 h TNF-α、IL-1β分泌开始增多，TNF-α 12 h达到高峰，IL-1β 24 h达到高峰，各时间点TNF-α、IL-1β的分泌均高于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 ELISA检测肾组织中细胞因子分泌情况

组别对照组HIE6hHIE12hHIE24hHIE48hTNF-α20.0±2.822.8±2.9*29.8±3.2*35.2±3.9*23.9±4.0*IL-1β1.7±0.92.1±0.9*2.8±0.6*3.2±0.8*2.2±0.5*

注：与对照组比较，*P<0.05

2.4 Western blot测定p-p38MAPK信号通路的变化 HIE组p-p38MAPK蛋白表达均高于对照组，差异显著(P<0.05)，其中HIE组中，6 hp-p38MAPK表达明显高于其他时间段，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

图4 不同组大鼠肾组织的p-p38MAPK表达

3 讨论

目前国内外关于HIE神经细胞凋亡的报道较多[5，6]，但脑组织损伤后造成其他器官功能改变的机制尚不甚清楚。本实验采用新生7 d Wistar大鼠HIE模型，通过流式细胞术检测HIE大鼠肾细胞的凋亡情况，结果表明，假手术对照组偶见阳性凋亡细胞，HIE组，6 h阳性凋亡细胞开始增加，24 h到达顶峰，且明显高于对照组(P<0.05)，证明HIE过程中，肾细胞存在凋亡现象。

细胞凋亡又称细胞程序化死亡，是由多基因控制的细胞生理性、自主性的死亡过程[7]。细胞发生凋亡主要有两种途径：死亡受体/Fas途径和线粒体途径，其中Caspase-8介导死亡受体/Fas途径，Caspase-9介导线粒体途径，两途径都是由Caspase的活化而启动的[8]。Caspase-8和Caspase-9下游分子均为Caspase-3，其是Caspase家族中最关键的效应蛋白酶，是发生凋亡的标志酶[9]。Caspase-9介导线粒体途径，主要受Bcl-2家族蛋白调控，Bax属于Bcl-2家族，为凋亡诱导蛋白。当Bax二聚体形式存在时，其在线粒体外膜形成离子通道从而改变线粒体的通透性，细胞色素C释放，激活Caspase-9，进而激活Caspase-3，促进细胞凋亡[10，11]。本实验测定HIE 状态下肾组织bax和Caspase-3蛋白的表达，结果表明，假手术对照组肾脏组织中bax和Caspase-3蛋白呈弱阳性，HIE组12 h开始出现较多的阳性细胞，24 h达到高峰，后缓慢降低，但仍高于对照组。将bax和Caspase-3蛋白的表达与流式细胞仪测得凋亡细胞数做相关分析，发现Bax和Caspase-3蛋白表达增加，凋亡细胞数也增加，提示在HIE模型中，通过激活Bax/Caspase-3通路诱导肾脏细胞的线粒体依赖性凋亡。

研究表明，在HIE模型中脑组织缺氧缺血后引发多种免疫细胞和免疫分子参与的炎性反应，造成免疫功能纷乱。Wixey等[12，13]研究证实，缺氧缺血后的新生鼠脑组织中 IL-1β和TNF-α水平增加。本实验利用ELISA首先来检测炎性细胞因子TNF-α和IL-1β的分泌，结果显示HIE组TNF-α和IL-1β的分泌均明显高于对照组，其中在HIE组中，24 hTNF-α和IL-1β的含量要高于其他组。同时WB检测p-p38MAPK蛋白的表达，HIE组中，6 h p-p38MAPK蛋白表达达到高峰，各时间点均高于对照组。肾组织在缺氧缺血的状态下，IL-1β和TNF-α等炎性因子水平增加，其做为上游因子可激活MAPK家族成员[14]，如p38MAPK，其通过下游的因子激活Bax和Caspase-3蛋白，促进细胞凋亡过程，以上结果提示p38MAPK磷酸化可能有促凋亡作用。

综上所述，研究证实在HIE新生大鼠肾细胞缺氧缺血的状态下，能诱导炎性细胞因子的分泌增加，从而激活p-p38MAPK信号传导通路，上调Bax和Caspase-3蛋白的表达，引起肾脏细胞凋亡，而且通过实验所设置的时间组来看，12～24 h的Bax和Caspase-3蛋白高表达，阐明对于HIE的患者，早期诊断，早期治疗有着重要意义。

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ExpressionofBaxandCaspase-3proteininkidneyofneonatalratswithhypoxic-ischemicencephalopathyaswellastheactionmechanismofapoptosisinrenalcells

LIUZhao*,LIYiming*,WANGJi,etal.*ClinicalCollegeofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050031,China

ObjectiveTo investigate the expression of Bax and Caspase-3 in kidney of neonatal rats with hypoxic-ischemic encephalopathy(HIE) as well as the action mechanism of apoptosis in renal cells.MethodsHIE models were established in seven-day-old Wistar rats,then these rats were randomly divided into sham operation control group and HIE group.The rats were executed at 6h,12h,24h,48h after HIE and kidney tissues were obtained.The apoptosis condition of renal cells was detected by flow cytometry,and expression of Bax and Caspase-3 protein was determined by immunohistochemistry,the levels of TNF-αand IL-1β were detected by ELISA,and renal cells apoptosis and P38MAPK signaling pathway were examined by Western Blot.ResultsIn HIE group,positive apoptosis cells were increased at 6h and reached peak at 24h,which were significantly higher than those in control group in different time points(P<0.05).More Bax and Caspase-3 positive cells appeared at 12h in HIE group and peaked at 24h,and positive cells in different time points were significantly higher than those in control group(P<0.05).At 6h,the levels of TNF-αand IL-1βwere increased in HIE group,and TNF-αreached peak at 12h,however,IL-1βreached peak at 24h,and the levels of TNF-α and IL-1β in different time points were significantly higher than those in control group(P<0.05).The expression levels of p-P38MAPK protein were increased at 6h in HIE group and reached the peak,and the expression levels of p-P38MAPK protein were significantly higher than those in control group in different time points(P<0.05).ConclusionThe expression levels of Bax and Caspase-3 in renal cells of neonate rats with HIE are increased,which suggests that the expression of Bax and Caspase-3 contributes to the apoptosis of renal cells via p-P38MAPK signaling pathway.

Bax；Caspase-3；apoptosis；hypoxic-ischemic encephalopathy；renal cell；p-p38MAPK

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.11.001

050031 石家庄市，河北医科大学临床学院(刘钊、李易明)，教务处(王冀)，免疫教研室(李文建)；河北省保定市第一中心医院分院(王蕾)

李文建，050017 河北医科大学免疫教研室；

E-mail：liwenjian969@sohu.com

R 742.8

A

1002-7386(2014)11-1605-04

2013-12-11)