高效液相色谱法检测鸡肉中氟喹诺酮类药物残留量前处理方法的优化

李维铖，姬长云，张静洁，程汉奎，邓 超，钟佳莲，邓衔柏，沈祥广

(华南农业大学 兽医学院，广东 广州 510642)

高效液相色谱法检测鸡肉中氟喹诺酮类药物残留量前处理方法的优化

李维铖，姬长云，张静洁，程汉奎，邓 超，钟佳莲，邓衔柏，沈祥广

(华南农业大学 兽医学院，广东 广州 510642)

【目的】建立一种用高效液相色谱法快速检测鸡肉组织中5种氟喹诺酮类药物(诺氟沙星、环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星)残留量的方法.【方法】样品的提取液由乙腈与三氯乙酸溶液(质量分数2%)按体积比 1∶3的比例混合而成，流动相为乙腈-磷酸/三乙胺溶液(0.02 mol·L-1)，荧光激发波长280 nm，发射波长450 nm.【结果和结论】添加低、中、高浓度水平时，回收率为84.71%～99.66%，变异系数为0.20%～4.34%.该方法检测诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星的残留定量限为10 μg ·kg-1，达氟沙星的残留定量限为2 μg ·kg-1，沙拉沙星的残留定量限为20 μg ·kg-1.此法操作简单、实用，灵敏度高，可以满足鸡肉食品中氟喹诺酮类药物残留检测的需要.

高效液相色谱法； 氟喹诺酮类药物； 鸡肉； 药物残留； 方法优化

诺氟沙星(NOR)、恩诺沙星(ENR)、环丙沙星(CIP)、达氟沙星(DAN)和沙拉沙星(SAR)为常见的氟喹诺酮类抗菌剂，目前在畜禽生产中被广泛应用.此类药物使用不当导致的药物残留可能直接危害人体健康，也可能使致病菌产生耐药性，间接对人类健康造成影响[1- 2].多个国家和地区均规定了氟喹诺酮类药物的最高残留限量[1].检测动物源食品中氟喹诺酮类药物残留的方法有微生物法[3]、酶联免疫法(ELISA)[4]、毛细管区带电泳法[5- 6]、电解分析法[7]、高效液相色谱法(HPLC)[8-10]、高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)[11-14]等.目前，在鸡肉产品的检测中，常采用的方法是《动物性食品中氟喹诺酮类药物残留检测-高效液相色谱法》(农业部1025号公告14- 2008)[15].本试验以此标准为基础，简化了试验前处理方法，优化了检测过程.经试验验证，该法非常适合大批量处理样品，大量节省了处理时间和所需耗材，较大幅度降低成本，方法的灵敏度和回收率均可满足我国现行兽药残留检测分析的要求.

1 材料与方法

1.1 药品和试剂

恩诺沙星对照品、环丙沙星对照品、诺氟沙星对照品、达氟沙星对照品、沙拉沙星对照品，均为中国兽医药品监察所产品，磷酸二氢钾、磷酸、三乙胺、氢氧化钠溶液(分析纯，广州试剂厂)，乙腈(色谱纯，Fisher公司).

1.2 仪器和设备

Agilent高效液相色谱仪(美国Agilent公司)配荧光检测器，高速匀质机及振荡器(德国IKA公司)，高速台式冷冻离心机(美国Thermo公司).

1.3 试液配制

分别称取恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星对照品各10 mg，置于同一个10 mL容量瓶中，用0.05 mol·L-1的氢氧化钠溶液溶解定容至刻度，制得质量浓度均为1 mg·mL-1的混合储备溶液.准确称取达氟沙星对照品10 mg，0.05 mol·L-1的氢氧化钠溶液溶解定容至10 mL，使其质量浓度为1 mg·mL-1.准确称取沙拉沙星对照品10 mg，0.05 mol·L-1的氢氧化钠溶液溶解定容至10 mL，使其质量浓度为1 mg·mL-1.置2～8 ℃冰箱中保存备用，有效期1个月.

取上述恩诺沙星、环丙沙星和诺氟沙星的混和储备液100 μL，达氟沙星储备液20 μL，沙拉沙星储备液200 μL，置于同一个100 mL容量瓶中，用流动相定容至刻度，配置成恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星的质量浓度为1 μg·mL-1，达氟沙星质量浓度为0.2 μg·mL-1，沙拉沙星质量浓度为2 μg·mL-1的混合标准溶液.

提取液：称取2 g三氯乙酸于容量瓶中，加水至100 mL，制得的三氯乙酸溶液与乙腈按体积比3∶1的比例混合，搅拌均匀，得到提取液.

磷酸/三乙胺溶液：取磷酸3.4 mL，用水稀释至1 000 mL，配成0.02 mol·L-1的磷酸溶液，用三乙胺调pH至2.4.临用配制(易产生沉淀).

1.4 测定方法

1.4.1 供试材料的制备 将市售的鸡肉样品用高速匀浆机绞碎得到供试试料，将空白鸡肉样品绞碎得到空白试料，在空白试料中添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加试料.

1.4.2 提取与净化 称取1 g试料，置于匀浆杯中，加提取液4 mL，高速匀浆1 min.匀浆液转入15 mL聚丙烯离心管中，振荡30 min，16 000 r/min，离心8 min，取上清液过0.2 μm滤膜，装入进样瓶，待测.

1.4.3 色谱条件 色谱柱：Agilent TC-C18250 mm×4.6 mm(i.d)，粒径5 μm.流动相：V(0.02 mol ·L-1磷酸/三乙胺溶液)∶V(乙腈)=80∶20.流速：1 mL·min-1.检测波长：激发波长280 nm ；发射波长450 nm.进样量：20 μL.

1.5 线性范围与检出限

空白样品中加入混合标准液配制成的诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、达氟沙星、沙拉沙星系列标准溶液.高效液相色谱仪检测后，以峰面积为纵坐标，药物质量浓度为横坐标，进行线性回归分析.在空白样品中添加不同质量浓度混合标准溶液，按“1.4”的方法进行处理，检测后取信噪比S/N=3对应的样品浓度为方法检出限(LOD),信噪比S/N=10对应的样品浓度为方法定量限(LOQ).

1.6 回收率和精密度

向空白待测样品中分别添加3个浓度水平的混合标准液，按“1.4”的方法进行处理，每个浓度重复5次，连续做3个批次，计算回收率和变异系数.

2 结果与分析

2.1 色谱分析

在试验选定的条件下，测得诺氟沙星的保留时间为6.67 min，环丙沙星为7.19 min，达氟沙星为8.18 min，恩诺沙星为9.07 min，沙拉沙星为12.93 min，峰形尖锐，分离完全，空白组织样品在上述保留时间无干扰峰出现(图1).

2.2 方法的检出限及标准曲线

空白鸡肉样品中添加不同质量浓度的标准工作溶液 ，诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星的残留定量限为10 μg·kg-1，达氟沙星的残留定量限为2 μg·kg-1，沙拉沙星的残留定量限为20 μg·kg-1.诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星的线性范围为10～100 μg·kg-1，达氟沙星为2～20 μg·kg-1，沙拉沙星为20～200 μg·kg-1.对质量浓度不同的混合标准使用液进行色谱分析，工作曲线的线性范围、回归方程、相关系数见表1.可见，本方法灵敏度高、线性范围较宽，有一定的实用价值.

2.3 方法的回收率与精密度

对鸡肉样品分别进行4个浓度的添加试验，测得的回收率为84.71%～99.66%，批内变异系数为0.20%～4.42%，批间变异系数为0.33%～2.68%(表2).

1：诺氟沙星(0.1 μg·mL-1)；2：环丙沙星(0.1 μg·mL-1)；3：达氟沙星(0.02 μg·mL-1)；4：恩诺沙星(0.1 μg·mL-1)；5：沙拉沙星(0.2 μg·mL-1).

图1 标准溶液(a)、空白肌肉添加药品(b)、空白肌肉样品(c)的色谱图
Fig.1 The chromatography of standard solution of five fluoroquinolones(a),spiked sample(b),blank muscle tissue(c)

表1 方法的线性范围、回归方程与相关系数Tab.1 The linear ranges, regression equations and correlation coefficients

表2 回收率及相对标准偏差Tab.2 Recoveries and relative standard deviations

2.4 抽样检测

从市场上购买30个鸡肉样品，每份样品2个重复，按本方法进行制样和检测，结果发现一例鸡肉样品中诺氟沙星残留量为43.5 μg·kg-1，平行样品中诺氟沙星的质量浓度为41.4 μg·kg-1，其余样品均未检出氟喹诺酮药物的残留.表明该方法检测鸡肉中氟喹诺酮类药物残留量的重现性非常好，相对偏差保持在3%之内，数据可靠.

3 讨论与结论

3.1 样品前处理方法的优化

动物源食品中基质干扰复杂，富含脂肪和蛋白质，选择并优化样品的前处理方法对结果的准确性尤为重要.本试验在农业部1025号公告-14- 2008所采用方法[15]的基础上，对样品的前处理过程进行了一定的优化.该标准检测方法采用磷酸盐缓冲液提取完后，离心取上清液，过固相萃取柱，从而除去样品中的杂质.本试验的提取液由乙腈与质量分数为2%的三氯乙酸按体积比1∶3混合而配得，蛋白质在酸性条件下变性，离心出沉淀除掉杂质，而提取液中加入乙腈也与流动相中乙腈比例吻合，出峰较好.

比较其他相关研究，仲锋[16]在鸡组织中检测氟喹诺酮类药物残留量的回收率为70%～107%，变异系数小于10%；陈红等[17]在鸡排泄物中检测氟喹诺酮类药物的回收率为75%以上，批内变异系数在2.2%～10%之间，批间变异系数在6.2%～13.0%之间；而本试验测得的回收率为84.71%～99.66%，批内变异系数为0.20%～4.42%，批间变异系数为0.33%～2.68%.相较而言，本试验的回收率有了明显稳定的提高，精密度和准确度也相应改善了，定量限能满足日常采集样品的检测范围，而且检测的效率大大增加，节省了柱子的成本，减少了处理的时间，非常适用于样本量较大时的残留检测.

3.2 检测方法的稳定性

将新鲜配制的混合标准工作液50 μg·kg-1于4 ℃冰箱中避光保存1、3、5、7 d后上机检测，结果表明，被测药物保留时间基本不变，但浓度明显降低，可见标液在保存过程中不稳定，因此在测定过程中应该做到现用现配，处理完后的样品也应及时上机.

3.3 结论

本试验在农业部1025号公告-14- 2008所采用方法[15]的基础上，对样品的前处理过程进行了优化，使样品处理快捷便利，灵敏度高，重现性好，明显降低批量样品的检测成本，可有效应用于鸡肉食品品质的日常监控.

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【责任编辑柴 焰】

Anoptimizationstudyondeterminationoffluoroquinolonesresiduesinchickenmusclebyhighperformanceliquidchromatography

LI Weicheng, JI Changyun, ZHANG Jingjie, CHENG Hankui, DENG Chao, ZHONG Jialian, DENG Xianbai, SHEN Xiangguang

(College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

【Objective】 A method for rapid determination of five fluoroquinolones (norfloxacin，ciprofloxacin，danofloxacin，enrofloxacin，sarafloxacin) residues in chicken muscle using high performance liquid chromatography (HPLC) was established． 【Method】 The extracting solution of the chicken samples included a mixture of acetonitrile and trichloroacetic acid(the mass fraction of 2%). HPLC mobile phase consisted of acetonitrile and phosphate buffer (0.02 mol·L-1) with triethy lamine. Fluorometric excitation wavelength was 280 nm, and emission wavelength was 450 nm. 【Result and conclusion】 The recoveries of 5 fluoroquinolones were 84.71%-99.66% at three spiked level(low, medium, high), and the relative standard deviations (RSD) were 0.20%-4.34%.The limit of quantiation (LOQ) of norfloxacin, ciprofloxacin and enrofloxacin was 10 μg·kg-1. The LOQ of danofloxacin was 2 μg·kg-1，and the sarafloxacin was 20 μg·kg-1. The method is simple, practical, and sensitive. It can meet the needs of determination of fluoroquinolones in chicken muscle.

high performance liquid chromatography; fluoroquinolones; chicken muscle; residue; optimization

2013- 02- 21优先出版时间2014- 07- 17

优先出版网址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.S.20140717.0910.030.html

李维铖(1987—)，男，硕士研究生，E-mail：610659219@qq.com；通信作者：沈祥广(1970—)，男，高级兽医师，E-mail：shenxg@scau.edu.cn

省部产学研结合项目(2011B090400228)

李维铖，姬长云，张静洁 ，等.高效液相色谱法检测鸡肉中氟喹诺酮类药物残留量前处理方法的优化[J].华南农业大学学报，2014,35(5):14- 18.

S859

A

1001- 411X(2014)05- 0014- 05