人蛔虫和猪蛔虫线粒体nad5基因的序列分析

吴昌义，林瑞庆，何勇，刘国华

(1.重庆市璧山县畜牧兽医技术服务中心，重庆 璧山 402760；2.华南农业大学兽医学院，广东 广州 510642；3.新乡学院动物医学院，河南 新乡 453003；4.湖南农业大学动物医学院，湖南 长沙 410128)

人蛔虫和猪蛔虫线粒体nad5基因的序列分析

吴昌义1，林瑞庆2，何勇3，刘国华4*

(1.重庆市璧山县畜牧兽医技术服务中心，重庆 璧山 402760；2.华南农业大学兽医学院，广东 广州 510642；3.新乡学院动物医学院，河南 新乡 453003；4.湖南农业大学动物医学院，湖南 长沙 410128)

以采自中国不同地方的人蛔虫与猪蛔虫为研究对象，PCR扩增其线粒体烟酰胺脱氢酶亚基Ⅴ基因(nad5)的部分序列(pnad5)并进行序列测定，应用ClustalX 1.81程序对序列进行比对。结果显示：所获得的pnad5序列长度一致，均为556 bp；人蛔虫和猪蛔虫的pnad5序列差异仅为0.0%～2.6%，本研究结果支持人蛔虫与猪蛔虫是同一个种的结论。

人蛔虫；猪蛔虫；线粒体DNA；烟酰胺脱氢酶亚基Ⅴ基因(nad5)；序列分析

许多后生动物拥有紧凑的环形的线粒体基因组，大约14～20 kb。线粒体DNA(mtDNA)具有分子较小，结构简单、进化速度快、基因间不发生重组和母性遗传等特点，非常适合用于群体遗传学和生物进化学研究[7]。mtDNA作为一种可靠的遗传标记，已被广泛应用于寄生虫的种类鉴定及种系发育研究[8–12]。本研究利用来自中国3个省的人蛔虫和中国广东4个不同地方的猪蛔虫，分析其线粒体烟酰胺脱氢酶亚基Ⅴ基因(nad5)的部分序列的特征，旨在为判断人蛔虫与猪蛔虫是否为同一个种提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 虫体来源

3个人蛔虫虫体分别来自中国山东、宁夏、广东湛江；12个猪蛔虫虫体分别来自广东广州(5个)、深圳(4个)、湛江(2个)、阳江(1个)，详见表1。

表1 本研究所用的人蛔虫及猪蛔虫样品及其nad5序列的GenBank登录号Table 1 Geographical origins of Ascaris samples and their GenBank accession numbers for sequences of nad5 gene

1.2 主要试剂

DNA抽提试剂盒 Wizard DNA Clean–up System为Promega公司产品；蛋白酶K为Merk公司产品Taq DNA聚合酶、PCR试剂(Buffer、MgCl2、dNTPs 等)、DL2000 DNA Marker为大连宝生物公司产品

1.3 虫体总DNA的提取

每个成虫取一小段(1～2 cm)，分别放入不同的平皿中，用双蒸水反复冲洗后，分别放在已灭菌的1.5 mL离心管中，剪碎并研磨，分别加入30 μL蛋白酶K(50 μg/uL)和270 μL SDS裂解液，置于 37 ℃恒温培养箱中过夜消化。用Promega公司的DNA抽提试剂盒提取虫体DNA。提取的DNA样品置于–20 ℃的冰箱保存、备用。

1.4 目的基因片段的扩增

根据GenBank上已发表的猪蛔虫mtDNA序列[13]设计了用于扩增人蛔虫和猪蛔虫线粒体 nad5基因部分序列(pnad5)的引物(nad5–FS1:5′–TAGAGGGG CTATGAATACTG–3′; nad5–RA1: 5′– ACGGCCATC TTGTTGACCTA–3′)，由上海生工生物技术有限公司合成。 扩增体系为25 μL：ddH2O 15.75 µL；10× r–Taq PCR Buffer(Mg2+free) 2.5 µL；MgCl2(25 mmol/L 3.0 µL；dNTPs (2.5 mmol/L) 2.0 µL；引物 nad5–FS1 (50 mmol/L) 0.25 µL；引物nad5–RA1(50 mmol/L) 0.25 µL；r–Taq酶(5 U/µL) 0.25 µL；模板DNA 1.0 µL。扩增程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，进行35个循环，72 ℃延伸5 min。

PCR产物用1%TBE琼脂糖凝胶进行电泳检测

1.5 序列的分析测定

将PCR产物送北京华大技术有限公司测序；利用DNAStar5.01软件对测序结果进行比对分析。

2 结果与分析

2.1 nad5基因的PCR扩增结果

所有样品经PCR扩增后得到均为516 bp(去掉上下游引物)的pnad5片段，与预期的目的片段长度相符，且无非特异性扩增条带(图1)。

图1 人蛔虫和猪蛔虫样品nad5 序列PCR扩增结果Fig.1 PCR–amplified results of mtDNA nad5 from representative human and pig Ascaris samples

2.2 序列分析

对 15个人蛔虫、猪蛔虫样品进行核苷酸序列分析的结果显示，A+T的含量为68.60%～69.38%，这与已报道的猪蛔虫线粒体基因 AT含量(69.19%)一致。对同一地区的猪蛔虫样品pnad5序列的差异性进行比较，广州的差异性为0.2%～0.8%，深圳的差异性为0.2%～0.6%；湛江样品的差异无统计学意义。而对这4个地区样品之间的序列进行比较分析，发现存在较大的地域差异，差异性在 0%～2.4%。对 3个不同地区的人蛔虫核苷酸序列进行比较分析，发现差异性在 0.2%～0.6%，而把所有的人蛔虫和猪蛔虫样品序列进行比较分析，它们的差异性在0.0%～2.6%。

将所获得的人蛔虫与猪蛔虫样品分别与GenBank上发表的猪蛔虫(NC_001327)pnad5序列进行比较，差异性为0.2%～2.6%，人蛔虫和猪蛔虫与 GenBank上发表的猫弓首蛔虫(AM411622)、犬弓首蛔虫(AM411108)、马来西亚弓首蛔虫(AM412316)相比差异性较大，分别为 22.9%～23.4%和22.9%～23.4%；22.9%～23.4%和22.6%～23.4%；22.5%～22.8%和21.2%～22.8%。

3 讨 论

分子标记作为一种遗传标记，为分类学提供了很好的保障，用分子标记(特别是线粒体)来研究寄生虫的遗传进化具有其优势[17–18]。本研究中的线粒体 nad5基因，是研究物种系统进化与分类的一种理想的分子标记[19]。笔者对来自国内的人和猪蛔虫线粒体 nad5基因序列进行了遗传变异分析，结果表明，人蛔虫和猪蛔虫与犬弓首蛔虫、猫弓首蛔虫、马来西亚弓首蛔虫相比差异较大，而人蛔虫和猪蛔虫的nad5序列差异性仅为0.0%～2.6%，支持人蛔虫与猪蛔虫是同一个种的观点[20–22]。

本研究中有限的样品来源和pnad5所包含的有限的信息量都不利于精确分析人蛔虫与猪蛔虫的关系，而线粒体DNA受渐渗杂交和基因渗透等现象影响[23]，这种现象也阻碍人蛔虫与猪蛔虫的准确分类；因此，要想更准确地推演出人蛔虫与猪蛔虫是同一个种，还需进一步采用突变扫描测序法详细的检查来自不同地方和宿主的蛔虫线粒体和核糖体DNA的变异；使用分子检测工具，建立有效的方法去确定是否人和猪蛔虫有宿主特异性和交叉感染在流行区；建立感染试验，使用来源于人的蛔虫(特异性验证)去感染猪。

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责任编辑：罗 维

英文编辑：罗 维

Ascaris lumbricoides and Ascaris suum represent the same species based on sequence analysis of mitochondrial nad5 gene

WU Chang-yi1, LIN Rui-qin2, HE Yong3, LIU Guo-hua4*
(1.Animal Husbandry and Veterinary Technical Service Center of Bishan County, Bishan, Chongqing 402760, China; 2.College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 3.Xinxiang University, Xinxiang, Henan 453003, China; 4.College of Veterinary Medicine, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

Ascaris lumbricoides (A. lumbricoides) and Ascaris suum (A. suum) were collected from different areas in China to examine the sequence variation of mitochondrial NAPH dehydrogenase subuit 5 gene(nad5) by amplifying patial nad5 (pnad5) followed by sequence analysis. The results showed that the length of pnad5 sequences was 556 bp, sequence differences in the pnad5 was 0.0%～2.6% between the A. lumbricoides and A. suum samples. These results support that the A. lumbricoides and A. suum represent the same species.

Ascaris lumbricoides; Ascaris suum; mitochondrial DNA; nad5; sequence analysis

10.13331/j.cnki.jhau.2014.01.013网络出版时间：2014– – 00:00

Q958.9；Q959.17.2+.6

A

1007−1032(2014)01−0061−04

人蛔虫(Ascaris lumbricoides)与猪蛔虫(Ascaris suum)属于大型寄生线虫，分别寄生于人和猪的小肠内。人感染蛔虫可引起重大的公共卫生问题。据估计，全球大约有1.2亿人感染蛔虫，在热带和亚热带地区蛔虫感染十分普遍[1]。猪感染蛔虫，可导致精神沉郁、消瘦、贫血、黄疸、腹泻、生长不良等，甚至可引起仔猪死亡，严重危害养猪业的发展，同时也给国民经济带来巨大损失[1]。许多国家已将人蛔虫和猪蛔虫纳入公共卫生学范畴[2–3]。长久以来，关于人蛔虫与猪蛔虫的分类一直存有争议。一些学者认为人蛔虫和猪蛔虫是同一个种，而另外一些学者则认为是2个不同的种。为此，许多国内外学者从形态学、生理生化、免疫学和分子生物学等方面对这2种线虫进行了比较研究，但得到的结果也不尽相同[4–6]。

2013–07–31

教育部“长江学者和创新团队发展计划”项目(IRT0723)

吴昌义(1984—)，女，重庆荣昌人，硕士，主要从事分子寄生虫研究，wucy198499@126.com；*通信作者，liuguohua5202008 @163.com