稀盐溶液-孔雀绿法测定土壤速效磷的条件选择

高雅丽，刘金山，官利兰，张新明

(1 华南农业大学 资源环境学院，广东 广州 510642； 2 国家林业局 中南林业调查规划设计院，湖南 长沙 410014)

稀盐溶液-孔雀绿法测定土壤速效磷的条件选择

高雅丽1†，刘金山1，2†，官利兰1，张新明1

(1 华南农业大学 资源环境学院，广东 广州 510642； 2 国家林业局 中南林业调查规划设计院，湖南 长沙 410014)

【目的】探讨用孔雀绿比色法测定KCl稀盐溶液浸提磷的适宜条件.【方法】利用标准溶液和不同利用方式的土样，比较不同浸提和显色条件对稀盐溶液-孔雀绿法灵敏度和精密度的影响.【结果和结论】浸提适宜条件如下：土水比为1 g土∶20 mL水，震荡时间为0.5 h，浸提剂(氯化钾)浓度为0.02 mol·L-1；显色体系中各溶质适宜的最终浓度为：H2SO40.48 mo1·L-1、钼酸铵0.024 mol·L-1、孔雀绿质量浓度为0.06 g·L-1.缔合物最大吸收波长为620 nm，ρ(P)在0～0.2 mg·L-1范围内符合比耳定律，线性回归方程为A=3.894 3C+0.001(R2=0.999**,A为D620 nm,C为磷质量浓度)，ρ(P)检出限为0.002 mg·L-1.测定结果的准确度和精密度均较高，因此本法适宜于氯化钾稀盐溶液浸提液中磷的测定.

土壤； 速效磷； 稀盐溶液； 孔雀绿比色法

了解土壤中速效磷的供应状况，对于施肥有着直接的指导意义.在土壤速效磷的测定方法中，化学方法是最普遍的，其中以Bray-I，Mehlich-I和Olsen法以及后来提出的Mehlich-3法最常用[1].在我国土壤养分研究工作中，各地常用0.5 mol·L-1NaHCO3提取中性及石灰性土壤有效磷，用0.25 mo1·L-1的HC1-0.03 mol·L-1的NH4F提取酸性土壤有效磷[2-3].

水或稀盐溶液(如0.01 mol·L-1CaCl2)提取的磷具有与土壤溶液中的磷大致相当的特点[4]，而且水或0.01 mol·L-1CaCl2溶液不仅可以提取磷，还可以提取其他元素如氮、钾、钠、镁等.张新明等[5]曾使用0.02 mol·L-1KCl溶液进行了磷酸盐在水稻土中的等温吸附试验，并结合盆栽试验确立了广东省玄武岩母质发育水稻土的“磷临界平衡浓度”.那么能否用KCl稀盐溶液作为土壤速效磷的通用提取方法值得研究.

溶液中磷的测定，一般都用钼蓝法.通常由于磷在土壤中具有很强的固定作用，钼蓝法对水或0.01 mol·L-1CaCl2的土壤提取液并不灵敏.孔雀绿法是一种比较简便的测定低浓度磷的方法，原理是磷钼酸盐在较低pH下与孔雀绿形成绿色的离子缔合物，络合物的结构为(孔雀绿)3[PO4(Mo3O9)4].比色波长为610或630 nm[6- 8]，检出限为0.002 mg·L-1.它的灵敏度是钼蓝法的3倍多[9]，且测定需样量小.因此0.01 mol·L-1CaCl2溶液等低提取能力提取剂的土壤提取液的测定适宜用孔雀绿法[7-9].

0.02 mol·L-1KCl溶液也是一种提取能力较弱的提取剂，适用于养分含量较高的土壤或者检出限较低的分析.本研究采用KCl稀盐溶液提取、孔雀绿比色法对不同利用方式土样中的速效磷进行测定，并在此基础上对提取及测定条件进行了选择和优化.

1 材料与方法

1.1 土样采集

在3种利用方式的地块上采集18个土样.采样深度0～20 cm，随机采样后将土壤混匀，用四分法取l kg左右，风干后研磨并分别过2、1 mm筛，装袋备用.土样基础性质见表1.有机质用重铬酸钾-硫酸消化法，速效钾用中性醋酸铵-火焰光度法，碱解氮用碱解扩散法，速效磷采用Bray I法, pH采用电位测定法.

数据统计分析采用Excel 2003及DPS 8.01统计软件[10].

表1 供试土壤肥力指标

1.2 主要仪器和试剂

往复振荡机、UV-754分光光度计.

试剂Ⅰ:4.0 mo1·L-1H2SO4、0.20 mo1·L-1钼酸铵和0.5 g·L-1酒石酸锑钾溶液.

浓H2SO4217 mL缓慢地倒入600 mL水中，搅拌，冷却.17.66 g(NH4)6Mo7O24·4H2O和0.500 0 g KSbC4H4O7·1/2H2O溶解于约60 ℃的300 mL水中，冷却.然后将H2SO4溶液缓缓倒入另一溶液中，稀释定容至1 L，贮于聚乙烯试剂瓶中.

试剂Ⅱ：7.5 g·L-1聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol,PVA，乳化剂)和，1.0 g·L-1孔雀绿溶液.

7.5 g PVA溶解于约800 mL水中, 缓缓加热并不停地搅拌，直至全部溶解，冷却.然后将1.000 0 g孔雀绿溶解于此溶液中，稀释定容至1 L.

1.3 光密度测定方法

称取过1 mm筛的风干土样2.500 0 g，置于250 mL振荡瓶或三角瓶中，准确加入50 mL 0.02 mo1·L-1KCl溶液，加塞，在(25±1) ℃下振荡0.5 h后, 用无磷干滤纸过滤.

量取滤液8～40 mL置于50 mL容量瓶中，加入2滴20 g·L-1酒石酸锑钾，然后加入“试剂Ⅰ”6.00 mL，摇匀，放置约10 min后，再加入“试剂Ⅱ”3.00 mL，摇匀后定容，30 min后测定620 nm处光密度(D620 nm).

2 结果与分析

2.1 分光光度法相关条件的探索

2.1.1 缔合物吸收光谱 设置1组磷标准系列浓度，以试剂空白作为对照，在不同波长下比色.

从表2可以看出，波长在615～625 nm范围内，工作曲线的斜率较大，即相同质量浓度磷溶液的孔雀绿-磷钼杂多酸离子缔合物在此波长范围内光密度较大，且相关系数在0.999 2～0.999 4之间，差别很小.低于或高于此波长范围，工作曲线的相关系数均降低.因此，615～625 nm范围内的波长均是适宜的.本文选择620 nm为孔雀绿比色法的波长.

表2 不同波长下工作曲线的参数Tab.2 Parameters of working curve with different waves

2.1.2 显色条件的选择 1)聚乙烯醇(PVA)用量的影响:在50 mL容量瓶中加入0.5 mL 质量浓度为7.5 g·L-1的PVA溶液，显色液微浑浊，而加入3.0～6.0 mL则吸光度恒定，且稳定时间长.从图1可以看出PVA不同用量对光密度无明显影响，故本试验选择加入的量为4.5 mL，其在显色液中的最终质量浓度为0.45 g·L-1.

图1 PVA不同用量下的工作曲线Fig.1 Working curve with different doses of PVA

2)孔雀绿用量的影响：试验发现，随着孔雀绿用量的增加，试剂空白相对于水的光密度均增加；孔雀绿相同用量条件下，缔合物的光密度随磷标准溶液的质量浓度增加呈线性变化(图2).因孔雀绿是有色试剂，故加入的量应适宜，且加入过程中应保证操作的规范性，以减少试验误差.在50 mL容量瓶中加1 g·L-1孔雀绿溶液3.00 mL,KCl 稀盐溶液光密度的大小和稳定性较理想.

2.1.3 提取剂用量对比色结果的影响 分别用0.02 mol·L-1的KCl溶液和蒸馏水配制0.25 mg·L-1的磷溶液，然后分别移取40 mL磷溶液到50 mL容量瓶中，按步骤加入试剂，显色0.5 h后比色.经多次试验表明，对于质量浓度为0.2 mg·L-1的磷钼酸缔合物，加入KCl溶液和水二者的光密度的差值多在±0.01之内，两者的结果基本一致.因此在配制标准曲线时可以用蒸馏水代替0.02 mol·L-1的KCl溶液，在保证试验精确度的前提下简化试验步骤.

图2 孔雀绿不同用量下的工作曲线Fig.2 Working curve with different doses of malachite green

2.1.4 工作曲线 配制标准曲线，发现ρ(P)在0～0.2 mg/L范围内符合比耳定律，回归方程为A=3.8943C+0.001，相关系数(r)=0.999**(n=6,A为D620 nm，C为磷的质量浓度).摩尔吸光系数为1.21×105L·mol-1·cm-1.

2.2 提取条件的确定

2.2.1 土水比 为了探讨较为适宜的土水比，试验对比了土水比[m(土)/g∶V(水)/mL]分别为1∶20和1∶10 KCl (0.02 mol/L)溶液时的结果及二者的相关性.

对比土水比1∶20与1∶10时的结果(表3)可以发现，在2种条件下提取的速效磷量之间具有极显著的相关性,但1∶20时提取的速效磷量明显高于1∶10，故土水比1∶20为佳.

国内外关于土壤速效养分测定的常规分析方法中，土水比一般为1∶5或1∶10，个别为1.0∶2.5或1∶20[2].对于大多数磷提取剂来说，土水比和土壤酸碱性影响土壤磷提取效果,土壤pH高和较大的土水比均有可能降低磷的提取量[11-12].土水比影响CaCl2的提取效果，土水比减小，提取的P和K的数量增大，但不同土水比的提取数量间有较好的相关性[13-14].本试验用KCl溶液提取也得到了相似的结果.

表3 不同土水比条件下测定的速效磷含量

1) 土水比指m(土)/g∶V(水)/mL;表中数据为平均值±标准误，n=4.

2.2.2 提取时间 分别在震荡提取0.5、1.5、6、24、48、72 h后测定提取液的速效磷量，以寻找最佳振荡时间.探讨液相磷与固相磷处于动态平衡所需的时间时，如果提取时间过短，少于平衡时间则速效磷不能完全被提取，使得结果小于实际情况；如果提取时间过长则影响试验进度，使得工作时间延长.

从表4可以看出，0.5 h后从各土壤中提取的速效磷基本上都达到了平衡，0.5 h后提取的磷量增加不显著.有少量增加的原因可能是极少量缓效磷的释放，而这部分增加值可能不属于土壤速效磷的组成部分.

对不同振荡时间测得的速效磷含量进行回归分析，可以看出0.5 h的振荡时间与其他时间均有着很好的相关性，故选择振荡时间为0.5 h.

2.2.3 KCl溶液的浓度 分别用0.01、0.02和0.03 mol·L-1KCl溶液浸提3种土样，发现当KCl浓度在0.01～0.03 mol·L-1范围内时，从同一土样中提取的速效磷量基本相等，故选择浓度为0.02 mol·L-1的KCl溶液.磷的吸附解吸曲线中多选用0.01 mol·L-1CaCl2溶液，根据离子数大概等同原则，用0.02 mol·L-1KCl溶液替代0.01 mol·L-1CaCl2溶液，经试验发现浓度为0.02 mol·L-1的KCl溶液适宜，这与张新明等[5]试验条件一致.

2.2.4 土壤粒度 任选几个不同利用方式的土壤样品，风干磨碎，分别过2和1 mm筛，探讨不同颗粒大小对提取结果的影响.表5中，2组数据t检验的双尾显著性概率(P)= 0.091>0.05, 说明2种粒径下的速效磷值没有显著差异，且二者相关系数为1.0**(n=6)，说明2组数据呈极显著线性相关，故对于土样速效磷的提取，土样过2和1 mm筛均可.

表4 不同提取时间下测定的结果

1) 与0.5 h 平均值的相关系数，“**”表示在0.01水平极显著相关.

表5不同粒径对速效磷的影响

Tab.5Influencesofdifferentparticlesizesonavailablephosphorusanalysis

粒径/mm不同样品编号的速效磷/(mg·kg-1)245618P相关系数1)22.7218.840.232.435.630.0911.0**12.9318.780.272.535.79

1)“**”表示在0.01水平显著极相关.

2.3 试验的精密度和准确度及相关性分析

2.3.1 标准磷溶液的测定 按照孔雀绿比色方法的步骤，吸取磷标准溶液至25 mL容量瓶中，并按比例加入各种试剂进行缔合比色，溶液中最终的磷质量浓度分别为0.02、0.06和0.10 mg·L-1，测定并计算6次平行测定的误差大小，结果见表6.

表6标准磷溶液中磷的测定结果

Tab.6Measuredresultsofphosphorusinstandardsolution

样品编号ρ(磷)/(mg·L-1)标准值测定值相对误差/%10.020.02053.020.060.06081.730.100.10171.8

2.3.2 精密度 分别随机选取各种利用方式的土样各1个(编号分别为3、11和18)，然后对每个土样进行7次平行测定，3个土样的精密度分别为0.733%、6.690%和1.550%.

2.3.3 速效磷测定的准确度 向50 mL容量瓶分别加入质量为1、3和5 μg磷，用去离子水定容，进行回收率试验结果见表7.由表7可见，加入不同量的标准磷，都得到较好的回收率，且基本无差异，通过对相对标准差(RSD)的计算可知，磷含量越低，RSD越大，但都在试验允许的误差范围内，故该测定方法可靠.

表7不同添加量测定的磷回收率

Tab.7Therecoveryratesofdifferentaddingamountsofphosphorus

重复不同添加量测得磷量/μg磷回收率/%1μg3μg5μg1μg3μg5μg11.013.044.99101.0101.399.821.033.025.11103.0100.7102.231.043.075.04104.0102.3100.841.012.985.09101.099.3101.850.973.035.0897.0101.0101.6平均值1.013.035.06101.2100.9101.2

2.3.4 土壤提取液的磷回收率 吸取一定体积的土壤提取液(水稻土吸取20 mL,其他土吸取5 mL)于50 mL容量瓶中，然后加入3.00 μg磷,对各样品的磷回收率测定结果见表8.表8数据表明，加入土壤提取液后，磷的回收率在98%～101%之间，符合要求，说明土壤溶液对速效磷的测定无影响，故该方法适合土壤速效磷的测定.

表8 土壤提取液对添加磷的回收率的影响Tab.8 Influences of soil extract on recovery rates of adding amounts phosphorus

2.3.5 与其他常用化学提取方法的相关性分析 由表9可见，各种测定方法之间均达极显著相关，表明KCl稀盐溶液提取易溶性磷的量与其他方法提取磷的量极显著相关，因此可以使用KCl稀盐溶液提取态磷表征土壤速效磷状况，再根据土壤速效磷含量、土壤和植株之间的相互反应制定磷素丰缺指标，用于指导平衡施肥.

表9几种提取方法有效磷之间的相关性1)

Tab.9Correlationshipbetweenavailablephosphorusconcentrationswithdifferentextractionmethods

提取方法OlsenBray-ⅠMehlich-3KCl稀盐溶液Olsen1Bray-Ⅰ0.9869**1Mehlich-30.9835**0.9950**1KCl稀盐溶液0.9433**0.9390**0.9210**1

1) “**”表示在0.01水平极显著相关.

3 讨论与结论

孔雀绿法与传统的钼蓝法相比，测定结果无明显差异，但灵敏度明显提高，检测限降低.研究结果表明，磷钼杂多酸-孔雀绿显色体系的最大吸收波长为620 nm，测定时选择在615～630 nm之间均可，摩尔吸光系数为1.21×105L·mol-1·cm-1，ρ(P)在0～0.2 mg/L范围内符合比耳定律，线性回归方程为A=3.894 3C+0.001(C为溶液中磷质量浓度，A为620 nm处缔合物的光密度)，相关性良好(r=0.999**).

聚乙烯醇存在的条件下，孔雀绿-磷钼杂多酸离子缔合物最大吸收峰位于635、645及590 nm处，这可能与比色液不同酸度及试剂的生产厂家不同有关，经试验发现波长在610～630 nm之间光密度差异不显著，因此波长在此范围均可.

本试验所得摩尔吸光系数比其他报道(8.5×104L·mol-1·cm-1)[15]偏大，可能是孔雀绿用量的差异所致.在实际测定中由于个人习惯的差异，所加试剂也会稍有不同，因此需自行配制标准曲线而不能套用上述回归方程和摩尔吸光系数.

显色液中各溶质的最终浓度为：0.48 mol·L-1H2SO4、0.024 mol·L-1钼酸铵，0.06 g·L-1酒石酸锑钾，乳化剂为0.45 g·L-1PVA，孔雀绿为0.06 g·L-1.由于加入试剂较多，在不影响试验结果的前提下为了方便操作，可用4.0 mol·L-1H2SO4、0.20 mol·L-1钼酸铵，0.05 g·L-1酒石酸锑钾配制试剂 Ⅰ，用7.5 g·L-1PVA和1.0 g·L-1孔雀绿配制试剂Ⅱ.KCl溶液和水溶液比色结果基本一致.因此在配制标准曲线时可以用蒸馏水代替0.02 mol·L-1KCl溶液，在保证试验精确度的前提下简化试验步骤.

聚乙烯醇用量对显色反应的影响：聚乙烯醇保护胶存在下，碱性染料孔雀绿与磷钼酸形成稳定的缔合物.聚乙烯醇对光密度无显著影响，但是由于缔合物具有疏水性，易凝聚沉淀致使光密度不稳定，故加入适量聚乙烯醇从而起到促溶增稳作用. 聚乙烯醇可使处于高黏度溶剂中的缔合物上苯环的弛豫过程受阻，从而使溶液颜色不容易褪去[16].

孔雀绿用量对显色反应的影响：在磷钼二元杂多酸中引入具有强共轭效应的碱性染料大分子形成离子缔合物，可使经典的“钼黄”或“钼蓝”光度法灵敏度大为改观[17].加入孔雀绿后光密度明显增加，该方法的灵敏度是钼蓝法的3倍多[8].但是由于孔雀绿本身是有色溶剂，加入孔雀绿过多会导致空白光密度陡增，故加入的量应适宜.

提取剂用量对显色反应的影响:一般而言，配制标准曲线时也应加入相应的提取剂以与土壤提取液保持一致，消除由于提取剂影响产生的误差.但经试验发现KCl溶液和水溶液比色结果基本一致，因此在配制标准曲线时可以用蒸馏水代替0.02 mol/L的KCl溶液，在保证试验精确度的前提下简化试验步骤.

在土水比1∶20、振荡时间为0.5 h、 提取剂KCl的浓度为0.02 mol/L的提取条件下，KCl溶液提取土壤速效磷的准确度和精密度都较高.提取结果与常规方法相关性显著.本方法相对标准偏差在1.0%～2.0%(n=6)，磷的回收率在97.0%～104%之间，土壤提取液的磷回收率在97.0%～102.3%之间，磷检出限为0.002 mg/L.其准确度和精密度均较高，因此是一种方便易行、准确可靠的分析方法，适合KCl溶液提取磷的测定，即适合稀盐溶液或水样中微量磷的分析[6].且在配制标准曲线时可以用蒸馏水代替0.02 mol/L的KCl溶液.

需要注意的是孔雀绿具有高毒、高残留、致癌、致畸、致突变等副作用，在人体残留时间长，对人体的危害是积蓄式的，应用时应加以防护，即使用该方法需戴上橡胶手套，妥善回收废液并交有毒废液回收站处理.

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【责任编辑周志红】

Selectionofconditionsfordeterminingsoilavailablephosphorubydilutesaltsolution-malachitegreenmethod

GAO Yali1†, LIU Jinshan1,2†, GUAN Lilan1, ZHANG Xinming1

(1 College of Natural Resources and Environment, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China；2 Central South Forest Inventory and Planning Institute of State Forestry Administration; Changsha 410014, China)

【Objective】The method of available phosphorus characterized by phosphorus extracted in KCl dilute-salt solution was studied. 【Method】 By using standard solution and soil samples from different land use patterns, influences of different conditions during extracting and color-developing stages on the precision and accurancy of dilute-salt solution-malachite green method were studied. 【Result and conclusion】 The optimum conditions for extraction were as follows:1 g soil∶20 mL water for soil-water ratio, 0.5 h for oscillation, and 0.02 mol·L-1for concertration of KCl extracting solution; The optimum final concentrations of reagents for the color-developing system were as follows: H2SO40.48 mol·L-1，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.024 mol·L-1, malachite green 0.06 g·L-1. The association complex had a maximum absorption wavelength at 620 nm，and Beer’s law was obeyed in the P range of 0～0.2 mg·L-1with the linear regression equation beingA=3.894 3C+0.001(R2=0.999**)and P detection limit being 0.002 mg·L-1，and the method had high accurancy and precision as well. Thus the method is appropriate to determine phosphorus amount in KCl extracting solution.

soil; available phosphoru; dilute salt solution; malachite green spectrophotometry

2013- 02- 21优先出版时间2014- 01- 06

优先出版网址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.S.20140106.1550.002.html

高雅丽(1984—)，女，硕士, E-mail: gaoyali2008@163.com；刘金山(1986—)，男，硕士, E-mail: xiaoshanzi00@126.com；†：对本文贡献相同；通信作者：张新明(1965—)，男，副教授，博士，E-mail：xmzhang@scau.edu.cn

广东省科技计划项目(2012A020100004，2010B020310006)

高雅丽，刘金山，官利兰，等.稀盐溶液-孔雀绿法测定土壤速效磷的条件选择[J].华南农业大学学报，2014,35(2):40- 46.

S151.9

A

1001- 411X(2014)02- 0040- 07