阻断胸导管淋巴回流减轻急性出血坏死性胰腺炎引起肺损伤的机制研究

张 彬，贺德栋，赫 鹏 （新乡医学院第一附属医院普通外一科，河南 卫辉453100）

·基础与转化医学·

阻断胸导管淋巴回流减轻急性出血坏死性胰腺炎引起肺损伤的机制研究

张 彬，贺德栋，赫 鹏 （新乡医学院第一附属医院普通外一科，河南 卫辉453100）

目的：探讨急性出血坏死性胰腺炎引起急性肺损伤（ALI）的发病机制．方法：将成年雄性 Wistar大鼠 36只随机分为假手术组、急性出血坏死性胰腺炎组和AHNP＋胸导管结扎组三组．采用胰胆管逆行注入牛磺胆酸钠建立急性出血坏死性胰腺炎模型，测定血清肿瘤坏死因子（TNF-α）水平及胰腺、肺脏、小肠组织髓过氧化物酶（MPO）活性，测定大鼠的支气管肺泡灌洗液蛋白含量和 TNF-α水平．光镜下观察大鼠肺、小肠、胰腺组织病理损伤情况．结果：AHNP组血清 TNF-α水平和支气管肺泡灌洗液蛋白含量均高于假手术组，胰腺、肺脏、小肠MPO活性和病理损伤评分均显著高于假手术组；AHNP＋胸导管结扎组 TNF-α水平和支气管肺泡灌洗液蛋白含量较 AHNP组明显降低，肺组织 MPO活性和病理损伤评分均显著低于 AHNP组，而在小肠和胰腺 MPO活性和病理损伤评分较 AHNP组升高．结论：腹腔淋巴液是 AHNP引起 ALI的可能原因，阻断胸导管淋巴回流可以减轻 AHNP引起的急性肺损伤．

胸导管结扎；急性出血坏死性胰腺炎；急性肺损伤

0 引言

急性出血坏死性胰腺炎（acute hemorrhagic necrotizing pancreatitis，AHNP）临床过程凶险，其病死率高［1－2］．目前研究证实，AHNP引起急性肺损伤（acute lung injury，ALI）高达60% ～70%［3－4］，而急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是急性肺损伤的一个终末结局，成为 AHNP的主要死亡原因［5－6］．因此，寻找减轻急性肺损伤的方法对降低 AHNP的死亡率及改善疾病的预后具有重要意义．有研究发现，淋巴循环可以介导急性肺损伤，并进而导致肺和全身的炎症反应，本研究通过阻断急性出血坏死性胰腺炎大鼠的胸导管，阻断腹腔淋巴液进入肺，观察其对急性肺损伤的影响，探讨 AHNP时 ALI的发病机制．

1 材料和方法

1．1 材料 成年雄性Wistar大鼠36只，体重（250± 20）g，由中国医学科学院辐射实验动物中心提供．将动物保持在12 h光照／黑暗周期与自由饮水和标准饲料．经过7 d驯化后被随机分为3组，每组12只．

1．2 主要试剂 肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）试剂盒购自晶美生物工程有限公司，髓过氧化酶（myeloperoxidase，MPO）检测试剂盒、蛋白测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所．

1．3 急性出血坏死性胰腺炎模型建立 称重后戊巴比妥钠60 mg／kg腹腔注射麻醉，成功后大鼠仰卧位

并无创固定四肢于实验台，颈部常规消毒铺单，于左或右侧下领角下方作横行切口，切开皮肤约 1．0 cm，于皮下找到颈静脉，充分游离，静脉远端结扎，于结扎线近端血管穿刺并置入硅胶管（硬膜外麻醉管），1号线缝扎固定后寻找十二指肠缝合皮肤．腹部备皮，消毒铺巾，腹部取剑突下正中切口，长约 1．5 cm，进腹后沿幽门，将其提至切口外，暴露十二指肠胰胆管入口处，用7号针头穿刺胰胆管开口对侧十二指肠壁，将拉细的硬膜外导管于穿刺口插入，经胰胆管开口轻轻导入胰胆管内约0．5 cm，1号线缝扎固定，用小动脉夹夹闭胰胆管近肝端，以0．24 mL／min的速度注射35 g／L牛磺胆酸钠（1．1 mL／kg），注射后保持压力 3 min，观察胰腺出现水肿、出血、坏死等改变后，去血管夹、拆线、拔管．无损伤线修补十二指肠穿刺口的浆肌层，十二指肠复位，关闭腹腔．

1．4 分组 假手术组：麻醉后开腹，仅轻轻翻动胰腺后关腹；急性出血坏死性胰腺炎（AHNP）组：按上述模型的操作步骤处理，注意动作轻柔，避免血管出血；AHNP＋胸导管结扎组（AHNP＋结扎组）：显露壁层腹膜的覆盖左肾的部分，于腹主动脉左后方查找淡乳白色的乳糜池及胸导管．在肾上腺至隔脚段分离出乳糜池及胸导管，结扎胸导管近心端，余步骤同 AHNP组．

1．5 标本的采集 注射牛磺胆酸钠 6 h后，处死动物，采集下腔静脉血5 mL，其中 1 mL置分离血清（3 000 r／min，3 min）进行血清内毒素检测；2 mL进行血清淀粉酶的测定，其余2 mL置于离心管中，分离血清（500 r／min，30 min），用于血清TNF-α测定．开胸后肺被仔细解剖至气管隆突水平，左主干支气管结扎．分别对右侧肺三个支气管内滴注3 mL PBS液进行灌洗液，保持在肺中为3 min，并通过重力回收到管内，回收约7．5 mL．支气管肺泡灌洗液离心（4 000 r／min，10 min）后，取上清液 －30℃冰箱保存备用．无菌操作下切取部分小肠、胰腺及左肺组织，将所取标本一部分于甲醛溶液中固定 48 h，经脱水透明、浸蜡、包埋后，切成4 μm石蜡切片 HE染色．另一部分组织用生理盐水洗三次，清除残血，用滤纸吸干，取小肠黏膜组织、左肺组织及胰腺组织各0．5 g，分别加入40℃磷酸盐缓冲溶液 5 mL制成匀浆，匀浆液离心3 500 r／min，离心1 min，取上清－70℃冰箱保存．采用比色法测定血清和组织匀浆中 MPO活性，采用ELISA法测定血清 TNF-α，自动生化分析仪测定血淀粉酶水平．

2 结果

2．1 胸导管结扎对 AHNP大鼠肺、小肠、胰腺组织病理损伤的影响 假手术组镜下可见肺泡轻度水肿，小肠黏膜绒毛完整，胰腺组织基本正常，各脏器组织未见中性粒细胞浸润．AHNP组镜下可见小肠绒毛破损，上皮细胞水肿明显，胰腺组织广泛出血坏死，大量炎性细胞浸润，肺泡组织弥漫性毛细血管扩张充血，肺泡间隔重度水肿，部分已破裂．AHNP＋胸导管结扎组镜下见小肠黏膜和胰腺组织损伤程度同 AHNP组相近，肺泡组织血管充血程度较AHNP减轻，肺泡间隔中度水肿．具体病理评分见表1．

表1 各组 AHNP大鼠脏器病理评分的对比 （n＝12）

2．2 各组AHNP大鼠肺脏、小肠、胰腺MPO活性的变化 AHNP组的各脏器MPO活性显著高于假手术组；AHNP＋结扎组肺组织 MPO较 AHNP组明显下降，而小肠和胰腺MPO较AHNP组显著升高（表2）．

表2 各组AHNP大鼠肺脏、小肠、胰腺MPO活性的变化（n＝12，U／g）

2．3 各组 AHNP大鼠血清淀粉酶和 TNF-α的变化

AHNP组较假手术组血清淀粉酶和 TNF-α均显著升高，AHNP＋结扎组与 AHNP组比较，血淀粉酶无明显变化，而TNF-α显著下降（表3）．

表3 各组 AHNP大鼠血清淀粉酶、TNF-α的变化 （n＝12）

2．4 阻断腹腔淋巴流对各组 AHNP大鼠的支气管肺泡灌洗液蛋白和 TNF-α的影响 AHNP组较假手术组支气管肺泡灌洗液蛋白和 TNF-α水平均显著升高，AHNP＋结扎组气管肺泡灌洗液蛋白和 TNF-α水平较AHNP组均显著降低（表4）．

表4 各组 AHNP大鼠支气管灌洗液（BALF）蛋白与 TNF-α的水平变化 （n＝12）

3 讨论

急性出血坏死性胰腺炎临床过程凶险，其病死率高，其炎症的始动因素是胰腺腺泡内胰酶异常激活，继而引起全身反应［2，7］，急性肺损伤是机体过度炎症反应导致肺血管内皮细胞和肺泡上皮细胞广泛破坏的结果［3］．通过在重度烧伤、感染性休克的研究中发现，肠系膜-胸导管淋巴液可以介导严重感染／创伤等引起的肺脏损伤，临床及动物实验发现各种原因引起的多器官功能障碍综合症常首先出现ARDS，而肺是首个接纳肠系膜淋巴液的器官，腹腔淋巴液可能起着介导肺损伤的作用［8－9］．MPO是中性粒细胞胞质中的一种特异性酶，组织中 MPO水平可间接反映中性粒细胞浸润和激活的程度［10］，本实验发现，AHNP组小肠、胰腺、肺脏组织 MPO含量均比假手术组明显升高，而胸导管结扎组小肠、胰腺较 AHNP组显著升高，而肺组织MPO较AHNP组显著下降，而且肺组织的病理损伤较 AHNP组明显减轻，其原因可能是胸导管结扎后小肠淋巴液进入肺脏通路被阻断，小肠内毒素与炎性介质无法进入肺脏有关，而且胸导管结扎可以减轻肺组织中性粒细胞浸润，启动细胞的内源性保护机制，进而提高抗氧化能力，减轻组织损伤．TNF-α是由激活的巨噬细胞、内皮细胞、中性粒细胞等分泌的具有多功能的多肽，在炎症反应过程中起着十分重要的作用［11］．TNF-α可以诱导氧自由基的产生，促进中性粒细胞产生氧自由基等活性氧递质并导致组织损伤［12－13］．本实验发现胸导管结扎组血清和肺组织中 TNF-α含量和支气管灌洗液的蛋白含量均较AHNP组下降，提示胸导管结扎后肺泡通透性明显减轻，使肺组织的中性粒细胞的聚集减轻，进而减少TNF-α的激活，抑制炎症级联反应，减轻肺脏损伤．

综上所述，急性出血坏死性胰腺炎早期即可引起急性肺损伤，胸导管结扎可减少肺组织中性粒细胞浸润和肿瘤坏死因子-α释放，减轻肺损伤，但对小肠和胰腺损伤无明显改善，提示腹腔淋巴液回流是急性出血坏死性胰腺炎引起急性肺损伤的可能原因．

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Blocking thoracic duct lymph flow attenuates acute hemorrhagicnecrotizing pancreatitis associated lung injury in rats

ZHANG Bin，HE De-Dong，HE Peng
Department of General Surgery，First Affiliated，Xingxiang Medical university，Weihui 453100，China

AIM：To investigate the pathogenesis of acute hemorrhagic necrotizing pancreatitis induced acute lung injury（ALI）．METHODS：36 male Wistar rats were randomly divided into 3 groups：sham operation group，AHNP group，AHNP＋Ligation of thoracic duct group．Rat AHNP model was induced by retrograde injection of 3．5%sodium deoxycholate into the biliopancreatic duct．At 6 h after model induction，the bronchoalveolar lavage fluid（BALF）were collected for determination of tumor necrosis factor-alpha（TNF-α），and the tissues of lung，intestine and pancrease were harvested individually for pathohistological evaluation and the myeloperoxidase（MPO）activity determination in each group．RESULTS：The pathohistological damage and MPO of lung，intestine and pancrease，TNF-α of BALF and serum were all increased in AHNP group compared to those in sham operation group．In AHNP＋ligation group，the pathohistological damage and MPO of lung and TNF-α of BALF were reduced，but the pathohistological damage and MPO of intestine and pancrease were increased compared with AHNP group．CONCLUSION：Abdominal lymphatic is the pathogenesis of ALI induced by AHNP，thoracic duct ligation can reduce neutrophil infiltration and TNF-α release and then attenuates lung injury in rats with AHNP．

thoracic duct ligation；thoracic duct drainage；acute hemorrhagic necrotizing pancreatitis；acute lung injury

2095-6894（2014）05-006-03

2014-08-12；接受日期：2014-08-25

张 彬．硕士，主治医师．研究方向：肠缺血再灌注损伤．E-mail：binbin801215＠163．com

R657．5＋1

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