β3肾上腺素能受体激动剂对小鼠脂肪细胞中UCP1和磷酸化p38蛋白表达的影响

孙高洁,王 姣,崔 岩,王守俊

郑州大学第一附属医院内分泌科 郑州 450052

β3肾上腺素能受体激动剂对小鼠脂肪细胞中UCP1和磷酸化p38蛋白表达的影响

孙高洁,王 姣,崔 岩,王守俊#

郑州大学第一附属医院内分泌科 郑州 450052

#通讯作者，男，1967年11月生，博士，主任医师，研究方向：2型糖尿病的发病机制和防治，E-mail:wangshoujun02@126.com

β3肾上腺素能受体激动剂；脂肪细胞;解偶联蛋白1;p38/MAPK通路；小鼠

目的：探讨β3肾上腺素能受体激动剂CL-316243对脂肪细胞中解偶连蛋白1(UCP1)表达的影响。方法将3T3-L1前脂肪细胞诱导成为脂肪细胞，随机分为4组，分别采用常规培养基(空白对照组)、10 μmol/L p38/MAPK抑制剂SB203580(SB203580组)、10-7mol/L β3肾上腺素能受体激动剂CL-316243联合10 μmol/L SB203580(CL-316243+SB203580组)、10-7mol/L CL-316243(CL-316243组)处理。48 h后，RT-PCR法检测4组细胞中UCP1 mRNA表达水平，Western blot法检测空白对照组、CL-316243+SB203580组和CL-316243组细胞中p38蛋白磷酸化程度。结果CL-316243组、空白对照组、SB203580组和CL-316243+SB203580组细胞中UCP1 mRNA的表达水平差异有统计学意义(FCL-316243=204.043,FSB203580=151.736,F交互=143.308,P<0.001)，CL-316243组表达水平较其他3组明显增高(P<0.05)。CL-316243组细胞中p38蛋白磷酸化程度较空白对照组和CL-316243+SB203580组升高(F=137.339,P<0.001)，后2组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论CL-316243可能通过激活p38/MAPK信号通路，促进脂肪细胞中UCP1的表达。

随着人们生活方式的改变和生活水平的提高，肥胖症和2型糖尿病的发病率逐年升高。人体内有两种脂肪组织，即白色脂肪组织(white adipose tissue，WAT)和棕色脂肪组织(brown adipose tissue，BAT)，WAT与BAT在能量代谢中发挥着截然相反的作用,WAT主要通过甘油三酯贮存能量, 而BAT则消耗能量[1]，高水平的BAT有助于减轻体重和维持机体血糖稳态[2-3]。因此促使WAT向BAT转化可能是一个治疗肥胖症比较有效的方法。目前研究[4]发现,β3肾上腺素能受体激动剂可刺激WAT的脂解，也可诱导WAT向BAT的转化。解偶联蛋白1(unconpling protein 1,UCP1)是一种在BAT中特异表达的线粒体内膜蛋白质,是决定棕色脂肪组织功能的关键因素[5-6]，因此，它可成为一个衡量WAT向BAT转化的特异性指标。作者观察了选择性β3肾上腺素能受体激动剂CL-316243对小鼠脂肪细胞中UCP1和p38/MAPK信号通路蛋白表达的影响，探讨β3肾上腺素能受体激动剂对WAT棕色化的影响及作用机制，为肥胖症、糖尿病等相关代谢性疾病的诊治提供新的研究思路。

1 材料与方法

1.1细胞来源和主要试剂小鼠前脂肪细胞株3T3-L1细胞购自武汉博士德公司。地塞米松(dexamethasone，Dex)、胰岛素、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤(1-methyl-3-isobuthylxanthine，IBMX)和CL-316243均购自Santa Cruz公司；Trizol试剂购自TaKaRa公司；逆转录试剂盒和PCR Master Mix购自北京全式金公司;p38 MAPK抑制剂SB203580、p38抗体、磷酸化p38(p-p38)抗体及辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG均购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2细胞的培养及诱导成熟将3T3-L1前脂肪细胞接种于含体积分数10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，于37 ℃、体积分数5%CO2条件下培养，待细胞生长至完全融合后换用含1 μmol/L Dex、0.5 μmol/L胰岛素、0.5 mmol/L IBMX的DMEM高糖培养基诱导分化，3 d后换用含1 μmol/L Dex、0.5 μmol/L胰岛素的DMEM高糖培养基继续培养，每2 d换液1次，至第10天，约90%的细胞呈脂肪细胞表型，经油红O染色鉴定，证实为脂肪细胞。

1.3实验分组细胞分化成熟后，随机分为4组，分别采用常规培养基(空白对照组)、10 μmol/L SB203580(SB203580组)、10-7mol/L CL-316243联合10 μmol/L SB203580(CL-316243+SB203580组)、10-7mol/L CL-316243(CL-316243组)处理。

1.4细胞中UCP1mRNA的检测细胞处理48 h后，采用RT-PCR法检测UCP1 mRNA。根据GenBank中的UCP1(NM_009463.3)和内参β-actin(NM_007393)基因序列设计引物， UCP1基因引物由宝生物公司合成，内参β-actin引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。UCP1引物序列：上游5’-CACTCAGGATTGGCCTCTACGAC-3’，下游5’-GCTCTGGGCTTGCATTCTGAC-3’；β-actin引物序列：上游5’-GTCCCTCACCTCCCAAAA-3’，下游5’-GCT GCCTCAACACCTCAACCC-3’。用Trizol试剂提取细胞总RNA,逆转录合成cDNA,以其为模板进行PCR扩增。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 变性30 s，55.7 ℃(UCP1)或64.5 ℃(β-actin)退火30 s，72 ℃延伸20 s，35个循环；72 ℃再延伸10 min。扩增产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳，用UVP公司的VisionWorks LS软件进行分析，以目的条带与内参条带灰度值的比值作为目的基因mRNA的表达水平。

1.5细胞中p-p38蛋白的检测收集空白对照组、SB203580组和CL-316243+SB203580组处理48 h的细胞，提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，采用Western blot检测p38、p-p38蛋白。SDS-PAGE胶上每泳道上样37.5 μg蛋白，电泳、转膜、封闭，一抗均稀释1 000倍，摇床4 ℃孵育过夜，TBST洗膜5 min×3次，加HRP标记的二抗(稀释1 000倍)孵育1 h，洗涤3次后DAB显色。用UVP公司的VisionWorks LS软件进行分析，以目的条带与内参条带灰度值的比值作为目的蛋白的表达水平。以p-p38/p38×100%表示p38磷酸化的程度。

1.6统计学处理应用SPSS 17.0进行统计学分析，4组间UCP1 mRNA表达水平的比较采用2×2析因设计的方差分析,3组间p38磷酸化程度的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1油红O染色鉴定结果见图1。

图1 贴壁后(A)及分化后(B，油红O染色)细胞的形态观察(×100)

2.2 4组脂肪细胞中UCP1mRNA表达水平的比较见图2及表1。CL-316243组细胞中UCP1 mRNA的表达水平较空白对照组、SB203580组和CL-316243+SB203580组明显升高(P<0.05)。

2.3空白对照组、CL-316243+SB203580组和CL-316243组脂肪细胞中p38磷酸化程度的比较见图3和表2。CL-316243组细胞中p38磷酸化程度较空白对照组、CL-316243+SB203580组明显升高；后2组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

图2 4组脂肪细胞中UCP1 mRNA的表达

A:空白对照组；B：SB203580组；C:CL-316243+SB203580组；D:CL-316243组。

表1 4组细胞中UCP1 mRNA表达水平的比较(n=3)

FCL-316243=204.043,FSB203580=151.736,F交互=143.308,P<0.001。

图3 3组细胞中p-p38蛋白的表达

A:空白对照组；C：CL-316243+SB203580组；D:CL-316243组。

表2 3组细胞中p38磷酸化程度的比较

F=137.339,P<0.001;*:与其他2组比较，P<0.05。

3 讨论

β3 肾上腺素能受体主要调节机体的脂肪分解和产热过程，它被激活后可上调UCP1的表达,从而诱导WAT的棕色化[7]。已有文献[8]指出，去甲肾上腺素刺激β3肾上腺素能受体后可激活cAMP-PKA通路，引起UCP1快速调节物(如FFA)的释放，也可激活p38/MAPK通路，从而上调UCP1的表达。

该研究结果显示，CL-316243组细胞中UCP1mRNA表达水平和p38磷酸化程度均较空白对照组明显升高,说明CL-316243可促进脂肪细胞中UCP1的表达和p38的磷酸化，激活p38/MAPK信号传导通路；SB203580组细胞UCP1 mRNA表达水平与空白对照组比较差异无统计学意义，说明p38抑制剂本身并不会影响脂肪细胞中UCP1的表达；CL-316243组细胞中UCP1 mRNA表达水平和p38磷酸化程度均高于CL-316243+SB203580组，说明p38抑制剂SB203580确实抑制了p38的磷酸化，而之前已验证p38抑制剂SB203580本身并不会影响UCP1的表达，所以p38/MAPK信号通路可能参与了CL-316243诱导UCP1表达的过程。

因此，可以看出，β3肾上腺素能受体激动剂在诱导WAT棕色化过程中发挥了一定的作用，这就为临床上研究新型高效能的抗肥胖和糖尿病药物提供了新的实验依据。

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[2]孙慧,杨娜娜,黄雪芳,等.棕色脂肪组织特异性基因在抵抗肥胖中作用的研究[J].临床消化病杂志,2013,25(1):3

[3]Asensio C,Jimenez M,Kühne F,et al.The lack of β-adrenoceptors results in enhanced insulin sensitivity in mice exhibiting increased adiposity and glucose intolerance[J].Diabetes,2005,54(12):3490

[4]Festuccia WT,Blanchard PG,Richard D,et al.Basal adrenergic tone is required for maximal stimulation of rat brown adipose tissue UCP1 expression by chronic PPAR-gamma activation[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,2010,299(1):R159

[5]孙长颢,刘荣,闻颖,等.解偶联蛋白在肥胖抵抗中的作用[J].中国公共卫生,2004,20(2):171

[6]肖放,孙野青.解偶联蛋白及功能研究进展[J].生命的化学,2003,23(1):14

[7]刘昭前,孙红,刘亚利,等.特异性 β3 肾上腺素能受体激动剂研究进展[J].中国药理学通报,2005,21(10):1153

[8]Brondani LA,Assmann TS,Duarte GC,et al.The role of the uncoupling protein 1 (UCP1) on the development of obesity and type 2 diabetes mellitus[J].Arq Bras Endocrinol Metabol,2012,56(4):215

(2013-11-07收稿 责任编辑王 曼)

Effect of β3-adrenoceptor agonist on expression of UCP1 and phosphorylated p38 in mouse adipocytes

SUNGaojie，WANGJiao，CUIYan，WANGShoujun

DepartmentofEndocrinology,theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

β3-adrenoceptor agonist;adipocyte;uncoupling protein 1;p38/MAPK;mouse

Aim: To investigate the effect of β3-adrenoceptor agonist CL-316243 on expression of uncoupling protein 1(UCP1) in mouse adipocytes. Methods: 3T3-L1 preadipocytes were induced into adipocytes,then the adipocytes were divided into four groups:blank control group, p38/MAPK inhibitor SB203580 group,10-7mol/L CL-316243 combined with SB203580 group,10-7mol/L CL-316243 group.The adipocytes were treated with these regents for 48 h,then the expression level of UCP1 mRNA was evaluated by RT-PCR,and the phosphorylated p38(p-p38) was evaluated by Western blot. Results: The expression level of UCP1 mRNA in CL-316243 group was higher than those in the other 3 groups(FCL-316243=204.043,FSB203580=151.736,Finteraction=143.308,P<0.001).The p-p38 expression in CL-316243 group was higher than those in the blank control group and CL-316243 + SB203580 group(F=137.339,P<0.001)，but those in the other 2 groups had no statistical significance(P>0.05).Conclusion: β3-adrenoceptor agonist CL-316243 can promote the expression level of UCP1 in adipocytes through activating p38/MAPK signaling pathway.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.03.012

R589.2